Diseño de Ligadura Cecal y Punción e Infección Intranasal Modelo Dual de Inmunosupresión Inducida por Sepsis
Summary
Este protocolo describe técnicas para medir los resultados infecciosos subyacentes a las infecciones secundarias adquiridas en el hospital en la condición inmunosupresora, primero estableciendo ratones de ligadura/punción cecal y luego desafiándolos con infección intranasal a crear un modelo clínicamente relevante de la sepsis de inmunosupresión.
Abstract
La sepsis, una infección grave y complicada potencialmente mortal, se caracteriza por un desequilibrio entre las respuestas pro y antiinflamatorias en múltiples órganos. Con el desarrollo de terapias, la mayoría de los pacientes sobreviven a la fase hiperinflamatoria, pero progresan a una fase inmunosupresora, lo que aumenta la aparición de infecciones secundarias. Por lo tanto, la mejora de la comprensión de la patogénesis subyacente a las infecciones hospitalarias secundarias en la fase inmunosupresora durante la sepsis es de enorme importancia. Aquí se informa un modelo para probar los resultados infecciosos mediante la creación de infecciones de doble impacto en ratones. Un procedimiento quirúrgico estándar se utiliza para inducir peritonitis polimicrobiana por ligadura y punción de cecal (CLP) y seguido de infección intranasal de Staphylococcus aureus para simular la neumonía que ocurre en la supresión inmune que se ve con frecuencia en pacientes sépticos. Este modelo dual puede reflejar el estado inmunosupresor que ocurre en pacientes con sepsis prolongada y susceptibilidad a la infección secundaria por neumonía nosocomial. Por lo tanto, este modelo proporciona un enfoque experimental simple para investigar la fisiopatología de la neumonía bacteriana secundaria inducida por sepsis, que puede ser utilizada para descubrir nuevos tratamientos para la sepsis y sus complicaciones.
Introduction
La sepsis inicia una compleja interacción de procesos proinflamatorios y antiinflamatorios delhuésped y se caracteriza por una respuesta hiperinflamatoria y disfunción inmune posterior 1,2. La sepsis representa una prioridad sanitaria mundial y causa un altonúmero de muertes en las unidades de cuidados intensivos (ICU) 3. Se estima que la incidencia de sepsis supera los 30 millones de casos en todo el mundo al año, con tasas de mortalidad de hasta el 30% a pesar de los avances en la gestión de la UCI4,5. En 2017, la Organización Mundial de la Salud adoptó una resoluciónpara mejorar la prevención, el diagnóstico y la gestión de esta enfermedad mortal 5. Sin embargo, estudios recientes han ilustrado que la muerte no es el resultado de una infección primaria en pacientes sépticos graves, sino más bien de una infección nosocomial secundaria (particularmente neumonía) causada por la inmunosupresión6,7 . Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de por qué los pacientes sépticos desarrollan infección secundaria y descubrir tratamientos más eficaces son urgentemente necesarios. En este caso, se describe un modelo dual, también conocido como modelo de doble hit, para estudiar el fenómeno inmunosupresor que se produce en pacientes con sepsis prolongada.
Como el modelo experimental estándar de oro en la investigación sobre sepsis polimicrobiana, ligadura y punción cecal (CLP) es una cirugía caracterizada por ligadura de cecum y perforación, que contribuye a la peritonitis polimicrobiana y la sepsis8,9 . El proceso fisiopatológico y los perfiles de citoquinas, junto con la cinética y la magnitud, son similares a la sepsis clínica. La posición de la ligadura, el tamaño de la aguja utilizada para la punción y el número de pinchazos de cecal son factores principales que afectan la mortalidad después de la CLP.
La neumonía nosocomial es la principal causa de mortalidad entre los pacientes en estado crítico con sepsis. El principal tipo de organismos que causan sepsis graves incluye Staphylococcus aureus (20,5%), pseudomonas (19,9%), Enterobacteriacae (principalmente E. coli, 16,0%) y hongos (19%). Mientras tanto, estudios recientes han sugerido una creciente incidencia de organismos grampositivos, que ahora son casi tan comunes como las infecciones gramnegativas3.
El método descrito en este protocolo implica CLP, realizado como el “primer golpe” para inducir peritonitis polimicrobiana subletal, que manifiesta una condición de inmunosupresión. El procedimiento también implica la posterior inslación intranasal de S. aureus como el “segundo golpe” para proporcionar una plataforma de investigación clínicamente relevante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como modelo estándar de oro para la investigación de la sepsis, CLP tiene una combinación de tres insultos, incluyendo traumatismo tisular causado por la laparotomía, necrosis debido a la ligadura del cecum, y la infección como resultado de la fuga microbiana que causa peritonitis con translocación de bacterias en la sangre8. Por lo tanto, CLP imita la complejidad de la sepsis humana mejor que muchos otros modelos. Sin embargo, una limitación importante del modelo CLP actual es la incapacid…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, y AI097532-01A1 a M. W. Las instalaciones principales de la Universidad de Dakota del Norte contaron con el apoyo de subvenciones de NIH (INBRE P20GM103442 y COBRE P20GM113123). Este trabajo también fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (81530063) a Jianxin Jiang. Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Marvin Leier (Centro de Salud Rural, Universidad de Dakota del Norte) por hacer el video.
Materials
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
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