ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence
Summary
אנו מציגים את הפרוטוקולים לבחון התפתחות הלב העכבר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלם על העכבר עוברי גזור מן חדרית ספציפי MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע בכל שלב של היווצרות חדרית במהלך התפתחות הלב העכבר מבלי מהגידולים שיטות מעבדה הומנית.
Abstract
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את שיטת ניתוח העכבר עוברי והדמיה של צ’יימברס חדרית עובריים בעכבר במהלך התפתחות הלב באמצעות חדרית כתב פלורסנט ספציפי טוק-אין עכברים (עכברים MLC-2v-tdTomato). פיתוח לב כרוך צורה צינור הלב ליניארי, הצינור הלב לולאה, ארבעה septation קאמרית. אלה תהליכים מורכבים מאוד נשמרים כל גולגולת. בלב עובריים בעכבר כבר בשימוש נרחב עבור מחקרים התפתחותיים הלב. עם זאת, עקב גודלם קטן מאוד, לנתח לבבות עובריים בעכבר הוא טכנית מאתגר. בנוסף, ויזואליזציה של הלב קאמרית היווצרות לעיתים קרובות צריך היברידיזציה, ביתא-galactosidase מכתים באמצעות LacZ כתב עכברים או immunostaining הלבבות עובריים המחולקת למקטעים. כאן, אנו נתאר כיצד לנתח לבבות עובריים בעכבר והמחש ישירות קאמרית חדרית היווצרות MLC-2v-tdTomato עכברים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלמה. בשיטה זו, אפשרי לבחון באופן ישיר את הלב צינור היווצרות לולאה ואת היווצרות קאמרית ארבע ללא נוסף ניסיוני מניפולציה של העכבר עוברי. למרות הקו MLC-2v-tdTomato כתב בטוק העכבר נמצא בשימוש פרוטוקול זה כדוגמה, פרוטוקול זה ניתן להחיל קווים העכבר הטרנסגניים אחרים כתב פלורסנט הלב ספציפיים.
Introduction
תא צורה במהלך התפתחות הלב היא תהליך מורכב מעבר מיגדרי העובריים מורפולוגית ברורים מספר1,2. צורת חרמש האוכלוסייה ובתאים לב צורות צינור הלב ליניארי, ואז עובר התארכות של לולאה כדי ליצור צורת הספירלה של הלב המתפתח. לאחר תהליך septation שלה, הופכת את הלב המתפתח בלב תאיים ארבע. הפרעה של כל התהליכים האלה תוצאות התפתחותיות לב מולדים. לכן, חשוב להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס היווצרות קאמרית במהלך התפתחות הלב. למרות אינספור מחקרים קודמים על פיתוח של הלב, ההבנה שלנו של תהליך מורכב זה נותר מוגבל.
היברידיזציה באתר אימונוהיסטוכימיה, ביתא-galactosidase מכתים שימוש בעכברים כתב LacZ היה בשימוש נרחב ללמוד קאמרית היווצרות במהלך התפתחות הלב עכבר על-ידי תיוג הלב ספציפי או חדר גנים ספציפיים מבנית או חלבונים (למשל, Nppa, הפיכה-TFII, Irx4, MLC-2a ו- MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. עם זאת, ניסויים אלה באמצעות העכבר עוברי דורשים זמן רב ומומחיות, כי מספר שלבים ניסיוני שונים צריך להיות המבוצעת באופן רציף11. כאן, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופ פלורסנטי הר שלמה פשוט לדמיין החדרים המתפתח באמצעות עוברי גזור MLC-2v-tdTomato כתב טוק-אין עכברים12. היתרון של שיטה זו לעומת שיטות השתמשו בעבר היא להימנע צעדים מורכבים ניסיוני, אשר עשויים לעיתים קרובות ליצור וריאציות ניסיוני. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר כיצד לנתח עוברי העכבר ולבבות המתפתח ולבחון כל שלב ההתפתחות קאמרית לב העכבר ללא ניסויים פתולוגיה מייגע. בשיטה זו ניתן להחיל בקלות כדי להעריך את התפתחות הלב באמצעות קווים העכבר הטרנסגניים שונים אחרים תיוג סמני לב מוקדם (למשל, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: רוזה mT /mG14, Nkx2-5Cre: רוזה mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: mT/mG רוזה14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15ועכברים16 TgMef2c-AHF-GFP).
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן הוא פשוט יחסית לבחון פיתוח קאמרית חדרית, מבלי לבצע ניסויים מהגידולים לתייג גנים מבני חדרית או מסוימים דום לב או חלבונים. לכן, בשיטה זו ממזערת את variabilities טכני נמצאו לעיתים קרובות בסעיפים הלב immunostained.
ישנם שני שלבים קריטיים לביצוע בהצלחה בשיטה זו כולל הערכה מ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R03 HL140264 (י’-ג’יי N) ותוכנית גלעד מדעי מחקר מלומד (י’-ג’יי N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O’Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O’Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
