Analyse af hjerte kammer udvikling under musen embryogenese bruger hele bjerget epifluorescensmikroskop
Summary
Vi præsenterer protokollerne for at undersøge mus hjerte udvikling ved hjælp af hele mount epifluorescerende mikroskopi på musen embryoner dissekeret fra ventrikulær specifikke MLC-2v-tdTomato reporter knock-i mus. Denne metode gør det muligt for os at direkte visualisere hvert trin af den ventrikulære dannelse under musen hjerte udvikling uden arbejdskrævende histokemiske metoder.
Abstract
Målet med denne protokol er at beskrive en metode til dissektion af musen embryoner og visualisering af embryonale mus ventrikulær kamre i hjertet udvikling ved hjælp af ventrikulær specifikke fluorescerende reporter knock-i mus (MLC-2v-tdTomato mus). Heart udvikling indebærer en lineær hjerte tube dannelse, hjertet røret looping og fire kammer septation. Disse komplekse processer er meget bevaret i alle hvirveldyr. Musen embryonale hjerte har været meget anvendt til hjertet udviklingsmæssige undersøgelser. Men på grund af deres meget lille størrelse, dissekere mus embryonale hjerter er teknisk udfordrende. Derudover behov visualisering af hjerte kammer dannelsen ofte in situ hybridisering, beta-galactosidase farvning bruge LacZ reporter mus eller immunfarvning af sektioneret embryonale hjerter. Her, beskriver vi hvordan man kan dissekere mus embryonale hjerter og direkte visualisere ventrikulær kammer dannelsen af MLC-2v-tdTomato mus bruger hele bjerget epifluorescerende mikroskopi. Med denne metode er det muligt at undersøge direkte hjerte tube dannelse og looping og fire kammer dannelse uden yderligere eksperimentelle manipulation af musen embryoner. Selvom MLC-2v-tdTomato reporter knock-i mus linje bruges i denne protokol som eksempel, kan denne protokol anvendes til andre hjerte-specifikke fluorescerende reporter Transgene mus linjer.
Introduction
Salen dannelse under hjertet udvikling er en kompleks proces skiftes gennem flere morfologisk særskilte vorden1,2. Halvmåneform af cardiac befolkning stamceller danner en lineær hjerte tube og derefter gennemgår strækforlængelse og springer for at danne formen spiral af udvikle hjertet. Efter sin septation proces, er udvikle hjertet omdannet til fire-chambered hjertet. Afbrydelse af nogen af disse processer resulterer i udviklingsmæssige hjertefejl. Det er således vigtigt at forstå de molekylære mekanismer bag kammer dannelse under hjertet udvikling. Trods adskillige tidligere undersøgelser på hjertet udvikling, vores forståelse af denne komplekse proces er stadig begrænset.
In situ hybridisering, immunhistokemi og beta-galactosidase farvning bruge LacZ reporter mus har været meget anvendt til at studere kammer dannelse under musen hjerte udvikling ved mærkning hjerte specifikke eller kammer specifikke strukturelle gener eller proteiner (fx Nppa, kup-TFII, Irx4, MLC-2a og MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Men disse eksperimenter ved hjælp af musen embryoner kræver betydelig tid og ekspertise, fordi flere forskellige eksperimentelle trin skal være udført sekventielt11. Her, beskriver vi en simpel hele mount epifluorescerende mikroskopi metode for at visualisere udvikle hjertekamrene ved hjælp af embryoner dissekeret fra MLC-2v-tdTomato reporter knock-i mus12. Fordelen ved denne metode i forhold til tidligere anvendte metoder er at undgå komplekse eksperimenterende trin, som kan ofte skabe experimental variationer. Hovedformålet med denne protokol er at beskrive, hvordan at dissekere mus embryoner og udvikle hjerter og undersøge hver fase af musen hjerte kammer udvikling uden kedelige histokemiske eksperimenter. Denne metode let kan anvendes for at vurdere hjerte udvikling ved hjælp af forskellige andre Transgene mus linjer mærkning tidlige hjerte markører (f.eks. Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, og TgMef2c-AHF-NGL16 mus).
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet her er forholdsvis simpel at undersøge ventrikulær kammer udvikling, uden at udføre arbejdskrævende eksperimenter for at mærke ventrikulær eller hjerte-specifikke strukturelle gener eller proteiner. Således, denne metode minimerer tekniske variabilitet, der ofte blev fundet i immunostained hjerte sektioner.
Der er to vigtige skridt for denne metode, herunder præcise skøn over de embryonale alder af mus og dissektion af embryonale hjerter er udført. Praktisk anslår …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) og Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O’Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O’Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
