Analyse van de ontwikkeling van de cardiale kamer tijdens muis embryogenese met hele Mount Epifluorescence
Summary
We presenteren de protocollen te onderzoeken muis hart ontwikkelen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende op muis embryo’s ontleed van ventriculaire specifieke MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen. Deze methode laat ons direct visualiseren van elke fase van de ventriculaire formatie tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis zonder arbeidsintensieve histochemische methoden.
Abstract
Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een methode voor de dissectie van muis embryo’s en visualisatie van muis embryonale ventriculaire kamers tijdens hart ontwikkelen met behulp van ventriculaire specifieke fluorescerende verslaggever knock-in muizen (MLC-2v-tdTomato muizen). Hart ontwikkeling betekent een lineaire hart buis formatie, hart buis looping, en vier kamer septation. Deze complexe processen zijn zeer bewaard in alle gewervelden. De muis embryonale hart is wijd verbeid gebruikt voor hart developmental studies. Vanwege hun extreem kleine grootte is ontrafeling van muis embryonale harten echter technisch uitdagende. Bovendien moet de visualisatie van cardiale kamer vorming vaak in situ hybridisatie, beta-galactosidase kleuring met LacZ verslaggever muizen of immunokleuring van verdeelde embryonale harten. Hier beschrijven we hoe om te ontleden van muis embryonale harten en direct visualiseren ventriculaire kamer vorming van MLC-2v-tdTomato muizen met behulp van microscopie van de hele berg epifluorescerende. Met deze methode is het mogelijk direct onderzoeken hart buis vorming en in een lus, en vier kamer vorming zonder verdere experimentele manipulatie van muis embryo’s. Hoewel de MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muis lijn als een voorbeeld in dit protocol wordt gebruikt, kan dit protocol worden toegepast op andere hart-specifieke fluorescerende verslaggever transgene muis lijnen.
Introduction
De formatie van de kamer tijdens de ontwikkeling van het hart is een complex proces dat overstappen via verschillende morfologisch verschillende embryonale fasen1,2. De halve maan vorm van cardiale voorlopercellen bevolking vormt een lineaire hart buis en vervolgens ondergaat rek en looping vormen de spiraalvorm van de ontwikkelingslanden hart. Na haar septation proces, het derde hart omgevormd tot het 4-chambered hart. Onderbreking van om het even welk van deze processen resulteert in developmental hartafwijkingen. Het is dus belangrijk om te begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vorming van de kamer tijdens de ontwikkeling van het hart. Ondanks talrijke eerdere studies over hart ontwikkeling blijft ons begrip van dit complexe proces beperkt.
Kruising in situ, immunohistochemistry, en beta-galactosidase kleuring met behulp van LacZ verslaggever muizen zijn wijd gebruikt om te bestuderen van de vorming van de kamer tijdens de ontwikkeling van de hart van de muis door labeling cardiale specifieke of kamer specifieke structurele genen of eiwitten (bijvoorbeeld Nppa, Coup-TFII, Irx4, MLC-2a en MLC-2v)3,4,5,6,7,8,9,10. Echter, deze experimenten met behulp van de muis embryo’s vereist heel wat tijd en deskundigheid, omdat meerdere verschillende experimentele stappen moeten worden uitgevoerd achtereenvolgens11. Hier beschrijven we een eenvoudige hele mount epifluorescerende microscopie methode om te visualiseren de ontwikkelende ventrikels gebruik van embryo’s van MLC-2v-tdTomato verslaggever knock-in muizen12ontleed. Het voordeel van deze methode ten opzichte van eerder gebruikte methoden is om te voorkomen dat complexe experimentele stappen die vaak experimentele varianten kunnen maken. Het hoofddoel van dit protocol is te beschrijven hoe te muis embryo’s en ontwikkelende harten ontleden en te onderzoeken elke ontwikkelingsfase muis cardiale kamer zonder vervelende histochemische experimenten. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast om te beoordelen hart ontwikkelen met behulp van verschillende andere transgene muis lijnen labeling van vroege cardiale markeringen (bijvoorbeeld, Mesp1Cre: Rosa26EYFP13, Isl1Cre: Rosa26EYFP13, Hcn4H2BGFP14, Hcn4Cre: Rosa mT /mG14, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG14, Hcn4-eGFP15, Isl1Cre: Rosa mT/mG14, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato15, en TgMef2c-AHF-GFP16 muizen).
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode is relatief eenvoudig te onderzoeken ventriculaire kamer ontwikkeling, zonder arbeidsintensieve experimenten om label ventriculaire of cardiale-specifieke structurele genen of eiwitten uit te voeren. Dus, deze methode minimaliseert technische variabiliteiten die vaak in immunostained hart secties gevonden werden.
Er zijn twee belangrijke stappen voor het succesvol uitvoeren van deze methode, met inbegrip van precieze schatting van de embryonale leeftijd van muizen en…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) en Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. N).
Materials
| dissecting microscope | Leica | MZ125 | |
| DNA ladder (100 bp) | Promega | G2101 | |
| epifluorescence dissecting microscope | Leica | M165 FC | |
| GoTaq Green master Mix | Promega | M712 | |
| PCR machine (master cycler) | Eppendorf | 6336000023 |
References
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
- Lee, K. J., et al. Myosin light chain-2 luciferase transgenic mice reveal distinct regulatory programs for cardiac and skeletal muscle-specific expression of a single contractile protein gene. Journal of Biological Chemistry. 267 (22), 15875-15885 (1992).
- Chen, J., et al. Selective requirement of myosin light chain 2v in embryonic heart function. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 1252-1256 (1998).
- Ross, R. S., Navankasattusas, S., Harvey, R. P., Chien, K. R. An HF-1a/HF-1b/MEF-2 combinatorial element confers cardiac ventricular specificity and established an anterior-posterior gradient of expression. Development. 122 (6), 1799-1809 (1996).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wu, S. P., et al. Atrial identity is determined by a COUP-TFII regulatory network. Developmental Cell. 25 (4), 417-426 (2013).
- Nelson, D. O., Jin, D. X., Downs, K. M., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Developmental Dynamics. 243 (3), 381-392 (2014).
- Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283 (5405), 1161-1164 (1999).
- Kubalak, S. W., Miller-Hance, W. C., O’Brien, T. X., Dyson, E., Chien, K. R. Chamber specification of atrial myosin light chain-2 expression precedes septation during murine cardiogenesis. Journal of Biological Chemistry. 269 (24), 16961-16970 (1994).
- Bardot, P., et al. The TAF10-containing TFIID and SAGA transcriptional complexes are dispensable for early somitogenesis in the mouse embryo. Development. 144 (20), 3808-3818 (2017).
- Zhang, Z., Nam, Y. J. Generation of MLC-2v-tdTomato knock-in reporter mouse line. Genesis. , (2018).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
- Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 15 (9), 1098-1106 (2013).
- O’Brien, T. X., Lee, K. J., Chien, K. R. Positional specification of ventricular myosin light chain 2 expression in the primitive murine heart tube. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5157-5161 (1993).
