Оценка универсального вложенного обратного транскрипционного цепной реакции для обнаружения Лисовивирусов
Summary
Пан-лиссавирус вложенной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции была разработана для обнаружения конкретно все известные лисовивирусы. Проверка с использованием образцов мозга бешенства различных видов животных показали, что этот метод имеет чувствительность и специфичность эквивалентно золотой стандарт флуоресцентного теста на антитела и может быть использован для рутинной диагностики бешенства.
Abstract
Для обнаружения вируса бешенства и других видов членов рода Лиссавируса в пределах семейства рхабдовиридае, Пан-лиссавирус вложенного обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ВЛОЖЕННЫЙ RT-СР) был разработан для обнаружения сохранялся регион нуклеопротеин (N) гена лисовивирусов. Метод применяет обратную транскрипцию (RT) с использованием вирусной РНК в качестве шаблона и олиго (dT)15 и случайных гексамеров в качестве праймеров для синтеза вирусной комплементарной ДНК (кДНК). Затем, вирусный cDNA используется в качестве шаблона для усиления 845 BP N фрагмент гена в первом раунде ЦР с использованием внешних праймеров, после второго раунда вложенного КЦР, чтобы усилить окончательный фрагмент 371 BP с использованием внутренней праймеров. Этот метод может обнаруживать различные генетические клады вирусов бешенства (RABV). Проверка, используя 9 624 образцов головного мозга от восьми видов домашних животных за 10 лет клинических диагнозов бешенства и эпиднадзора в Китае, показала, что метод имеет чувствительность 100% и специфичность 99,97% по сравнению с прямым флуоресцентным анализ на антитела (FAT), метод золотого стандарта, рекомендованный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Всемирной организацией по охране здоровья животных (МЭБ). Кроме того, метод мог бы также специально усилить целевой N фрагмент гена 15 других утвержденных и двух новых видов лизсавирусов в 10-м докладе Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV), как оценивается имитирующих обнаружение синтезированных N генных плазмид всех лизовивирусов. Метод обеспечивает удобную альтернативу FAT для диагностики бешенства и был одобрен как Национальный стандарт (GB/T36789-2018) Китая.
Introduction
Бешенство-это Всемирная зоонозная болезнь, вызываная вирусами в роду Lyssavirus1. Лисавирусы (Family рхабдовиридае)-ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЕ РНК-вирусы с приблизительно 12 КБ генома, который кодирует пять белков: N, Фосфоровирус (P), матричный белок (M), гликопротеин (G), и большой белок или полимеразы (L). На основе нуклеотидных последовательностей гена N, генетического расстояния и антигенных паттернов, лиссавирусами были разделены на 16 видов, включая классический вирус бешенства (rabv) и вирусы, связанные с бешенством (RRV): Лагос-летучая мышь (LBV), вирус duvenhage (дувв ), Вирус мокола (МОКВ), Европейская летучая мышь (EBLV-1), Европейская летучая мышь-лиссавирус 2 Австралийский летучая мышь (АБК), вирус Аравана (АРАВ), вирус Икама (иков), Бокело Бат-лиссавирус (BBLV), Ганнорува Бат лиссавирус (ГБЛВ), вирус Иркут (ИРКВ), Худжанский вирус (ХУВ), вирус Западно-кавказской летучей мыши (WCBV), вирус Симони bat (SHIBV) и Ллеида Бат-лиссарус (ллеб)2. Недавно были выявлены два дополнительных лисовируса: Kotalahti летучая мышь (KBLV), изолированная от летучей мыши Брандт (Myotis brandtii) в финляндии в 20173 и Тайваньская летучая мышь ЛИССАВИРУС (twblv), изолированный от японского пистрелле ( Пьпипиреллус абрамы) на Тайване, Китай в 2016 – 20174.
Все млекопитающие подвержены бешенству; Однако, никакие грубые патогномонические поражения или специфические клинические знаки не разрешают свою идентификацию, и диагноз можно только сделать в лаборатории5. Наиболее широко используемым методом диагностики бешенства является жир, который считается золотым стандартом как для ВОЗ, так и для МЭБ5,6. Тем не менее, жир может производить ненадежные результаты на деградированных/аутолzed образцов мозговой ткани. Кроме того, он не может быть использован для анализа биологических образцов жидкости, таких как спинномозговой жидкости (ЛИКВОРА), слюны и мочи, тем самым в значительной степени исключая его занятости в антеморной диагностики7. Альтернативные обычных диагностических тестов, таких, как бешенство ткани культуры инфекции тест (РЦКМЭ) и тест инокуляции мыши (MIT), требуют несколько дней6, основным недостатком, когда быстрый диагноз имеет важное значение.
Различные молекулярные диагностические тесты (например, обнаружение вирусной РНК с помощью RT-ЦР, терапия с иммуноферментной инфекцией (ЦР-ИФА), гибридизация на месте и в режиме реального времени (СР), используются в качестве быстрых и чувствительных методов диагностики бешенства8. В настоящее время “RT-ЦР” рекомендуется МЭБ для рутинного диагностирования бешенства, а в руководстве по диагностическим испытаниям и вакцинам для наземных животных МЭБ описано описание всех лисивирусов5. Здесь мы описываем “Пан-лиссавирус”, вложенный в-ЦР, что позволяет специфическое и чувствительное обнаружение всех 18 видов лиссавирусов, сопоставимых или превышающих полученные жиром. Принцип метода является RT целевой РНК (сохраняется область лизисавируса N гена) в кДНК, а затем усиление кДНК двумя раундами ЦР. CDNA подвергается в первом раунде КЦР с внешними праймеров, чтобы усилить фрагмент 845 BP; Затем, второй раунд ЦР использует в первом раунде продукта ЦР в качестве шаблона для усиления 371 BP фрагмент с внутренним праймеров. Два раунда ЦР значительно увеличивают чувствительность анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящее время, RABV является одним из основных лизсавирусов, ответственных за почти всех людей и животных, бешенства в Китае, а также в других странах. Кроме того, вариант ИРКВ был впервые идентифицирован с м.урина лойкогстер бат в провинции Цзилинь в северо-восточном Китае в …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследование было поддержано национальным ключевым научно-исследовательским планом развития (Грант No. 2016ИД0500401) и национальным фондом естественных наук Китая (Грант No 31302043).
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
