Lyssaviruses の検出のための普遍的な入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応の評価
Summary
汎オーストラリアコウモリリッサウイルス入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応は、すべての既知の lyssaviruses を特異的に検出するために開発されました。異なる動物種の狂犬病脳サンプルを用いたバリデーションは、この方法が、金標準蛍光抗体検査と同等の感受性および特異性を有し、日常的な狂犬病診断に使用できることを示した。
Abstract
ファミリー Rhabdoviridae内のオーストラリアコウモリリッサウイルス属の狂犬病ウイルスおよび他のメンバー種を検出するために、汎オーストラリアコウモリリッサウイルス入れ子逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (入れ子型 RT − PCR) を開発し、保存領域を検出した。lyssaviruses の核タンパク質 (N) 遺伝子の。この方法は、ウイルス RNA を鋳型として用いた逆転写 (RT)、およびオリゴ (dT)15およびランダム hexamers を、ウイルス相補 DNA (cDNA) を合成するためのプライマーとして適用する。次いで、このウイルス cDNA を、外部プライマーを用いた第1ラウンド PCR で 845 bp N 遺伝子断片を増幅させる鋳型として使用し、その後、第2ラウンドのネスト化 PCR を行い、内側のプライマーを用いて最終 371 bp フラグメントを増幅する。この方法は、狂犬病ウイルス (RABV) の異なる遺伝的クレードを検出することができます。この検証により、中国での臨床狂犬病診断およびサーベイランスの10年間における8つの家畜種からの9624の脳標本を用いて、その方法が直接蛍光と比較して 100% の感受性および 99.97% の特異性を有することを示した。抗体検査 (FAT) は、世界保健機関 (WHO) と世界動物衛生機構 (OIE) が推奨する金本位法です。さらに、この方法は、合成の模倣検出によって評価される、ウイルスの分類に関する国際委員会 (ICTV) の第10の報告書において、15件の他の承認された、および2つの新規オーストラリアコウモリリッサウイルス種の標的 N 遺伝子断片を特異的に増幅することもできる全ての lyssaviruses の N 個の遺伝子プラスミド。この方法は、狂犬病診断のための脂肪に代わる便利な手段を提供し、中国の国家標準 (GB/T36789-2018) として承認されています。
Introduction
狂犬病は、オーストラリアコウモリリッサウイルス属1内のウイルスによって引き起こされる世界的な人獣共通病である。Lyssaviruses (ファミリー Rhabdoviridae) は、5つのタンパク質 (N、エピレギュリンタンパク (P)、マトリックスタンパク質 (M)、糖タンパク質 (G)、および大タンパクまたはポリメラーゼ (L) をコードする約 12 kb のゲノムを持つ単一陰性鎖 RNA ウイルスです。N 遺伝子、遺伝的距離、および抗原パターンのヌクレオチド配列に基づいて、lyssaviruses は、16種に分けられ、古典的な狂犬病ウイルス (RABV) および狂犬病関連ウイルス (RRV) を含む: ラゴスバットウイルス (LBV)、Duvenhage ウイルス (DUVV)、Mokola ウイルス (MOKV)、欧州バットオーストラリアコウモリリッサウイルス 1 (EBLV-1)、欧州バットオーストラリアコウモリリッサウイルス 2 (EBLV)、オーストラリアバットオーストラリアコウモリリッサウイルス (ABLV)、Aravan ウイルス (ARAV)、生駒ウイルス (IKOV)、Bokeloh バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (BBLV)、Gannoruwa バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (GBLV)、Irkut ウイルス (IRKV)、ホジャンドウイルス (KHUV)、西コーカサスバットウイルス (WCBV)、シモニバットウイルス (SHIBV)、およびリェイダバットオーストラリアコウモリリッサウイルス (LLEBV)2.最近、2つの追加の lyssaviruses が同定されている: フィンランドのブラントのバット (Myotis brandtii) から分離した 20173と台湾バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (TWBLV) から孤立した KOTALAHTI バットオーストラリアコウモリリッサウイルス (KBLV) は、日本の pipistrelle (Pipistrellus abramus) 2016 年に台湾、中国で-20174.
すべての哺乳類は狂犬病に感染しやすい。しかし、総病的病変または特定の臨床徴候はその同定を許可せず、診断は実験室5でのみ行うことができる。狂犬病診断のための最も広く使用されている方法は、WHO と OIE5,6によって金本位として考えられている脂肪である。それにもかかわらず、脂肪は、劣化/autolyzed 脳組織サンプルで信頼性の低い結果を生成することができます。さらに、それは脳脊髄液 (CSF)、唾液および尿のような生物的液体の標本を測定するのに使用することができないそれにより antemortem 診断7の雇用を主に排除。代替の従来の診断試験は、狂犬病組織培養感染検査 (RTCIT) およびマウス接種試験 (MIT) など、数日6を必要とし、迅速な診断が必須である場合の大きな欠点である。
種々の分子診断試験 (例えば、RT-PCR によるウイルス RNA の検出、PCR −酵素結合免疫吸着アッセイ、「PCR − ELISA」、インサイチューハイブリダイゼーション、およびリアルタイム PCR) は、狂犬病診断のための迅速かつ高感度な技術として使用されている8.ルーチン狂犬病診断には OIE が推奨しており、heminested (hn) PCR は、地上動物が lyssaviruses5をすべて検出するための診断検査とワクチンの oie マニュアルに記載されています。ここでは、オーストラリアコウモリリッサウイルスネストされた RT-PCR を説明し、脂肪によって得られたものと同等またはそれを超えるすべての18オーストラリアコウモリリッサウイルス種の特異的および高感度検出を可能にする。この方法の原理は、標的 RNA の RT (オーストラリアコウモリリッサウイルス N 遺伝子の保存領域) を cDNA に、続いて2ラウンドの PCR による cDNA の増幅である。CDNA は、845 bp フラグメントを増幅するために、外部プライマーを含む第1ラウンド PCR を行います。次いで、第2ラウンド PCR は、第1ラウンド PCR 産物を鋳型として使用して、内部プライマーを有する 371 bp フラグメントを増幅する。PCR の2つのラウンドは、アッセイの感度を有意に増加させる。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在、RABV は、中国、および他の国でほぼすべての人間と動物の狂犬病に責任を負う主要なオーストラリアコウモリリッサウイルスです。さらに、IRKV 変異体は 201210年に中国北東部の吉林省のMユリナテスター leucogasterバットから最初に同定され、201711年に遼寧省で犬の死亡を引き起こすことが報告されています。最近では、2017年に中国台湾の…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、国家キー研究開発計画 (グラント 2016YFD0500401) と中国国家自然科学財団 (グラント 31302043) によって支援されました。
Materials
| 50 × TAE | Various | Various | |
| 6 × loading buffer | TakaRa | 9156 | |
| Agarose | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Various | Various | |
| DL 2,000 Marker | Takara | 3427A | |
| dNTPs (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2.5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Electrophoresis System | Tanon | EPS300 | |
| Ex-Taq (5 U/μL) | TakaRa | RR001 | |
| Gel Imaging System | UVITEC | Fire Reader | |
| Microcentifuge tubes | Various | Various | |
| M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) | TakaRa | 2641A | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| PCR Machine | BIO-RAD | T100 | |
| PCR Tubes | Various | Various | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymearase | NEW ENGLAND BioLabs | M0530S | |
| Pipettors | Various | Various | |
| Random Primer | TakaRa | 3801 | |
| RNase Inhibitor (40 IU/µL) | TakaRa | 2313A | |
| RNase-free ddH2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10×) | TakaRa | 9152A | |
| Tips | Various | Various | |
| Vortex mixer | Various | Various |
References
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