全细胞膜片电生理方法对突触倍数的评价
Summary
在这里, 我们提出了一个评估功能突触多样性的方案, 使用全细胞膜片夹具电生理学在急性脑片。
Abstract
在中枢神经系统中, 一对神经元通常形成多个突触触点和/或功能神经递质释放位点 (突触多样性)。突触多样性是可塑性的, 在整个发育过程中和不同的生理条件下都会发生变化, 是突触传递效果的重要决定因素。在这里, 我们概述了实验, 以估计多度突触终止到特定的突触后神经元使用全细胞膜片钳电生理学在急性脑片。具体而言, 电压夹具记录用于比较自发兴奋突触后电流 (sEPSCs) 和微型兴奋突触后电流 (mEPSCs) 的振幅之间的差异。这种方法背后的理论是, 由于在每个突触接触中发生的同步释放, 表现出多样性的传入输入将显示出巨大的、作用潜力相关的 sEPSCs。相反, 与动作电位无关的释放 (异步) 将产生较小的振幅 mEPSCs。本文概述了一组实验和分析, 以表征突触多样性的存在, 并讨论了该技术的要求和局限性。这项技术可用于研究不同的行为、药理或环境干预如何影响不同大脑区域突触的组织。
Introduction
突触传递是神经元之间沟通的基本机制, 因此也是大脑功能的基本机制。突触传输也是不稳定的, 可以改变其疗效在活动依赖的方式, 以及在对模块信号1的反应.因此, 检查突触功能一直是神经科学研究的重点。全细胞膜片钳电生理学是一种多功能的技术, 使我们能够了解, 通过设计实验设计和数据分析, 深入的生物物理和分子机制的突触传输。一个常用的方法, 也许是由于简单的技术和概念, 是测量微型兴奋器-抑制后电流 (me/ipsc) 下的电压夹配置 2,3,4 个,5,6. 单个 Mpsc 代表离子通过突触后电离受体 (如 AMPA 和 gaba a 受体) 的流动, 以响应从突触端子释放的各自神经递质的结合7.因为记录是在电压门控 na+通道阻滞剂河豚毒素 (ttx) 的存在下获得的, 所以释放是与作用电位无关的, 通常涉及一个包含神经递质的单突状囊泡。基于这一假设, Mpsc 的平均振幅被广泛用作量子大小的粗略估计, 它表示相对于单个释放位点的突触后受体的数量和功能。另一方面, Mpsc 的频率被认为是终止于突触后细胞的突触总数及其平均释放概率的组合。然而, 这些参数并不测量突触的另一个可变乘法, 或突触多样性–这对突触传递的有效性很重要。
根据突触传递的量子理论7,8,9, 一对神经元之间给定连接的强度取决于三个因素: 功能突触 (n) 的数量,突触后对单个突触囊的释放反应 (量子大小;Q) 和神经递质释放的概率 (pr)。突触多样性相当于n。突触多样性的发展或乘法突触的修剪是塑料的整个发展过程中, 处于不同的疾病状态3,4,6,10。因此, 描述突触多样性对了解突触传播在健康和疾病中的有效性具有重要意义。电子显微镜等技术可以通过检测来自同一轴突到同一突触后神经元 11,12 的多个突触触点来识别突触多样性的结构证据, 13,14。然而, 这些结构上标识的多突触可以功能上静默15,16。对 n 进行精确的功能检查需要技术上具有挑战性的电生理方法, 例如配对的全细胞记录, 可以确定给定的连接是否具有多个功能释放位点和最小值刺激方法, 旨在招募一个单一的假定轴突。
在这个协议中, 我们描述了一种简单的方法, 通过采用最初由 Hsia 等人2开发的方法来估计突触多样性。这项技术包括测量自发 psc (Spsc) 和 Mpsc 使用全细胞膜片夹电生理学, 这使得我们能够估计整个输入到给定神经元的突触多样性的程度。 如前所述, 突触多样性反映了给定突触前和突触后神经元之间的突触数。如果多个突触被一个动作电位在同步中吸收, 那么单个 (即量子) Psc 的时间总和的概率就很高, 从而产生更大的振幅 PSC。 在 mPSC 记录 (其中动作电位被 TTX 阻塞) 中, 单个 (非同步) Mpsc 的时间总和概率较低。利用这一原理, 可以通过将 sPSC 振幅 (与动作电位相关释放) 与 mPSC 振幅进行比较来估计突触多样性。
为了检验多样性的存在, 我们描述了四个实验及其分析, 以谷氨酸 Epsc 为例。然而, 同样的方法也可用于快速 Gabaergic/糖化反应 (Ipsc)。下面介绍了每个实验的简要原理。首先, 如上所述, 突触多样性可以通过比较 sEPSCs 的振幅和 mEPSCs 来估计。此方法有两个要求;1) 突触前轴突必须在记录过程中发射足够数量的动作电位, 2) p r必须很高, 以便多个突触在动作电位到达时释放神经递质。为了满足这些要求, sEPSCs 首先记录在低 Ca2 +人工脑脊液 (aCSF) 中, 然后记录在低浓度的 k+通道拮抗剂, 4-氨基吡啶 (4-ap) 的存在下, 以增加作用潜在的发射和p r。然后, 动作电位射击被 TTX 阻断, Pr 被电压门控 Ca2+通道阻滞剂 cd2 +所减少。将 sEPSCs 的振幅 (与 4AP) 与 mEPSC 的振幅 (与4AP、TTX 和 Cd2 +) 进行比较。在第二个实验中, Ca2 +被 Csf 中的等光 sr2 + 替换, 以消除囊泡释放。由于囊泡同步释放需要 Ca2 + , 因此用 sr2 + 替换应消除指示多样性的大振幅 sEPSCs。第三, 机械上, 多样性可以导致多个突触接触到相同的突触后神经元或多囊释放 (即多个囊泡释放在一个单一的突触接触)17,18。为了区分这两种类型的多样性, 第三个实验使用低亲和力, 快速离解竞争拮抗剂的 ampa-谷氨酰糖 (γ-dgg)17,18, 以确定是否大sEPSC 是独立突触或多囊释放的时间总和作用于突触后受体重叠种群的结果。如果大振幅事件产生于多泡释放, 与较小的 sEPSCs 相比, Γ-dgg 在抑制大方面的效果会更小, 而多个突触触点的时间总和所产生的大 sEPSCs 也会受到类似的影响, 也会受到类似的影响。Γ-dgg。在第四个实验中, 采用了一种更生理的方法来增强动作电位的激发, 即传入突触刺激。突触活动的爆发可以短暂地增加-促进受激传入的自发动作电位激发和释放概率。因此, 这种方法允许多样性以更多的生理方式表现出来。
下面的协议描述了在小鼠下丘脑组织中进行这些实验的方法。具体而言, 使用下丘脑 (PVN) 室旁核的促肾上腺皮质激素释放激素 (CRH) 神经元。我们描述了进行全细胞膜片钳电生理学的程序, 并解释了测试突触多样性的具体实验。
Protocol
Representative Results
Discussion
一个成功的膜片钳电生理学实验的一个重要要求是获得健康的切片细胞。我们描述的协议针对含有 PVN 神经元的下丘脑切片进行了优化。其他大脑区域可能需要修改溶液和切片方法21,22, 23,24.对于录音来说, 只有通过不断监测电池特性 (如膜电阻、电容和访问电阻), 才能接受稳定的记录是至关重要的。访…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. s. 获得安大略省研究生奖学金。我们收到了加拿大心理健康研究机构的新调查团契。这项工作得到加拿大自然科学和工程研究理事会 (06106-2015 RGPIN) 和加拿大卫生研究所 (PJT 148707) 向 wi 提供的业务赠款的支持。
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
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