Avaliação da multiplicidade sináptica usando células inteiras Patch-clamp eletrofisiologia
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a multiplicidade sináptica funcional usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda.
Abstract
No sistema nervoso central, um par de neurônios formam frequentemente múltiplos contatos sinápticos e/ou sites de liberação de neurotransmissor funcional (multiplicidade sináptica). Sináptica multiplicidade é plástico e mudanças ao longo do desenvolvimento e em diferentes condições fisiológicas, sendo um importante determinante para a eficácia da transmissão sináptica. Aqui, nós esboçamos experimentos para estimar o grau de multiplicidade das sinapses de terminação para um determinado neurônio pós-sináptico usando eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias cerebral aguda. Especificamente, a gravação de tensão-braçadeira é usada para comparar a diferença entre a amplitude das correntes pós-sináptico excitatórias espontâneas (sEPSCs) e correntes de pós-sinápticos excitatórios em miniatura (mEPSCs). A teoria por trás deste método é que entradas aferentes que apresentam multiplicidade mostrará sEPSCs grande, dependente do potencial de ação, devido à liberação de síncrona que ocorre em cada contato sináptico. Em contraste, o lançamento independente de potencial de ação (que é assíncrono) irá gerar menor amplitude mEPSCs. Este artigo descreve um conjunto de experiências e análises para caracterizar a existência de multiplicidade sináptica e discute os requisitos e limitações da técnica. Esta técnica pode ser aplicada para investigar como diferentes intervenções comportamentais, farmacológicas ou ambientais em vivo, afectar a organização de contatos sinápticos em áreas diferentes do cérebro.
Introduction
Transmissão sináptica é um mecanismo fundamental para a comunicação entre os neurônios e, portanto, funcionamento do cérebro. Transmissão sináptica também é lábil e pode alterar sua eficácia de forma dependente da atividade, bem como em resposta a sinais moduladora1. Assim, examinando a função sináptica tem sido um foco importante de pesquisa da neurociência. Eletrofisiologia do grampo de remendo de célula inteira é uma técnica versátil que permite-nos compreender, pela elaboração de projetos experimentais e análises de dados, em profundidade mecanismos biofísicos e moleculares da transmissão sináptica. Uma abordagem comumente usada, talvez devido a simplicidade da técnica e conceito, é a medição das correntes de pós-sináptico excitatório/inibitório em miniatura (mE / IPSCs) sob a tensão braçadeira configuração2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs individuais representam o fluxo de íons através de receptores pós-sinápticos geleificação (por exemplo, os receptores GABA e GABAA ) em resposta à ligação de seus respectivos neurotransmissores liberados do terminal pré-sináptica 7 . Porque a gravação é obtida na presença da voltagem-dependente Na+ canal bloqueador tetrodotoxina (TTX), o lançamento é independente do potencial de ação e normalmente envolve uma única vesícula sináptica que contém o neurotransmissor. Partindo deste pressuposto, a amplitude média de mPSCs é amplamente utilizada como uma estimativa crua para o tamanho de quantal, que representa o número e funcionalidade dos receptores pós-sinápticos, opondo-se um único lançamento de site. Por outro lado, a frequência de mPSCs é considerada para representar uma combinação do número total de sinapses encerra para a célula pós-sináptica e sua probabilidade média de lançamento. No entanto, esses parâmetros não meça outra variável-multiplicatividade de sinapses, ou multiplicidade sináptica — que é importante para a eficácia da transmissão sináptica.
Com base na teoria quantal da transmissão sináptica7,8,9, a força de uma determinada conexão entre um par de neurônios é dependente de três fatores: o número de sinapses funcionais (N), o resposta pós-sináptica para o lançamento de uma única vesícula sináptica (tamanho quantal; Q) e a probabilidade de liberação do neurotransmissor (Pr). Sináptica multiplicidade é equivalente a N. O desenvolvimento da multiplicidade sináptica ou a poda das sinapses multiplicativas é plástico durante todo o desenvolvimento e doença diferentes Estados3,4,6,10. Por esta razão, caracterizando a multiplicidade sináptica tem implicações importantes para compreender a eficácia da transmissão sináptica na saúde e na doença. Técnicas, tais como a microscopia eletrônica podem identificar evidências estruturais da multiplicidade sináptica através da detecção de múltiplos contatos sinápticos provenientes do mesmo axônio para o mesmo neurônio pós-sináptico11,12, 13,14. No entanto, essas multisynapses estruturalmente identificados podem ser funcionalmente silenciosa15,16. Análise funcional precisa de N exige que tecnicamente desafiador eletrofisiológicas abordagens, tais como gravações de células inteiras emparelhadas que podem identificar se uma determinada conexão tem vários sites de lançamento funcional mínima e abordagens de estimulação que visam recrutar um único axônio putativo.
Neste protocolo, descrevemos um método simples para estimar a multiplicidade sináptica, adoptando um método originalmente desenvolvido por Hsia et al2. Esta técnica envolve a medição de espontânea PSCs (sPSCs) e mPSCs usando eletrofisiologia braçadeira remendo de célula inteira, o que nos permite estimar o grau de multiplicidade sináptica através de todas as entradas para um determinado neurônio. Como definida anteriormente, sináptica multiplicidade reflete o número de sinapses entre um determinado neurônio pré e pós-sinápticas. Se múltiplas sinapses são recrutadas em sincronia por um potencial de ação, haverá uma grande probabilidade do somatório temporal das EPS (ou seja, quantal) individuais, gerando uma maior amplitude PSC. Nas gravações do mPSC (em que potenciais de ação são bloqueados por TTX), a probabilidade de somação temporal dos individuais (não-síncronas) mPSCs é baixa. Usando esta lógica, multiplicidade sináptica pode ser estimada, comparando a amplitude de sPSC (com liberação de dependente do potencial de ação) para a amplitude do mPSC.
Para examinar a existência de multiplicidade, descrevemos quatro experimentos e suas análises usando glutamatérgico EPSCs como exemplo. No entanto, a mesma abordagem pode ser usada para a rápida transmissão gabaérgica/glycinergic (IPSCs). Uma breve fundamentação para cada experimento é descrita abaixo. Em primeiro lugar, conforme explicado acima, multiplicidade sináptica pode ser estimada, comparando a amplitude de sEPSCs para mEPSCs. Há dois requisitos para esta abordagem; 1) pré-sináptica axônios de disparar um número suficiente de potenciais de ação durante a gravação, e 2) Pr deve ser alta para que múltiplas sinapses liberar neurotransmissores após a chegada de um potencial de ação. A fim de atender a esses requisitos, sEPSCs são primeiramente registrados em baixo Ca2 + artificial líquido cefalorraquidiano (aCSF) e em seguida na presença de uma baixa concentração do antagonista de canal de K+ , 4-aminopiridina (4-AP) para aumentar a ação disparo de potencial e Pr. Então disparando do potencial de ação é bloqueado por TTX e Pr diminuída uma voltagem Ca2 + bloqueador dos canais de Cd2 +. A amplitude da sEPSCs (com 4AP) é comparada com a de mEPSC (com 4AP, TTX e Cd2 +). No segundo experimento, Ca2 + é substituído por equimolar Sr2 + na aCSF para desynchronize liberação de vesículas. Como Ca2 + é necessária para a versão síncrona de vesículas, substituição com Sr2 + deve eliminar a sEPSCs de grande amplitude que sejam indicativos de multiplicidade. Em terceiro lugar, mecanicamente, multiplicidade pode resultar de qualquer vários contatos sinápticos ao mesmo neurônio pós-sináptico ou liberação multivesiculares (ou seja, múltiplas vesículas lançadas dentro de um único contato sináptico)17,18. Para diferenciar entre os dois tipos de multiplicidade, o terceiro experimento utiliza uma baixa afinidade, rápida dissociando antagonista competitivo dos receptores GABA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , para determinar se o grande sEPSC são o resultado de uma soma temporal das sinapses independentes ou liberação multivesiculares atuando sobre uma população de sobreposição de receptores pós-sinápticos. Se os acontecimentos de grande amplitude surgem de lançamento multivesiculares, γ-DGG será menos eficaz inibe a maior sEPSCs em relação ao menor, Considerando que grande sEPSCs que surgem a partir do somatório temporal de vários contatos sinápticos serão afetados da mesma forma por Γ-DGG. No quarto experimento, um método mais fisiológico é usado para aumentar o potencial de ação mista, nomeadamente aferente estimulação sináptica. Picos de atividade sináptica podem transitoriamente aumento/facilitar a probabilidade de queima e liberação de potencial de ação espontânea das afferents estimulada. Portanto, esta abordagem permite que a multiplicidade de manifestar de forma mais fisiológica.
O seguinte protocolo descreve o método para a realização dessas experiências no tecido hipotalâmico de rato. Especificamente, os neurônios de hormônio (CRH) liberando corticotropina do núcleo paraventricular do hipotálamo (PVN) são utilizados. Descrevemos os procedimentos para a realização de eletrofisiologia de braçadeira do remendo de células inteiras e explicar as experiências específicas para testar a multiplicidade sináptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um requisito importante para um experimento de eletrofisiologia braçadeira remendo bem sucedida é a obtenção de fatias/células saudáveis. Nosso protocolo descrito é otimizado para fatias hipotalâmicas que contêm neurônios PVN. Outro áreas podem exigir de cérebro modificado soluções e fatiamento métodos21,22,23,24. Para a gravação, é fundamental para aceitar apenas gravações …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.S. recebeu bolsa de pós-graduação de Ontário. Wi recebeu uma nova bolsa de investigador de pesquisa de Saúde Mental do Canadá. Este trabalho é apoiado por subvenções de funcionamento para Wi de ciências naturais e engenharia Conselho de pesquisa do Canadá (06106-2015 RGPIN) e o Instituto Canadense para pesquisa em saúde (PJT 148707).
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
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