Evaluering af Synaptic mangfoldighed ved hjælp af hele-celle Patch-klemme Elektrofysiologi
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere den funktionelle synaptic mangfoldighed ved hjælp af hele-celle patch klemme Elektrofysiologi i akut hjernen skiver.
Abstract
I det centrale nervesystem, et par af neuroner ofte danner flere synaptic kontakter og/eller funktionelle neurotransmitter frigivelse sites (synaptic mangfoldighed). Synaptic multipliciteten er plast og ændringer i hele udvikling og i forskellige fysiologiske betingelser, er en afgørende faktor for effekten af synaptisk transmission. Her, skitsere vi eksperimenter til vurdering af graden af mangfoldighed af synapser afslutning på en given postsynaptiske neuron bruger hele-celle patch klemme Elektrofysiologi i akut hjernen skiver. Specifikt, bruges spænding-clamp optagelse til at sammenligne forskellen mellem amplitude af spontan excitatoriske postsynaptiske strømme (sEPSCs) og miniature excitatoriske postsynaptiske strømme (mEPSCs). Teorien bag denne metode er, at afferente indgange, der udviser mangfoldighed vil vise store, aktionspotentialet-afhængige sEPSCs på grund af den synkrone udgivelse, der opstår på hver synaptic kontakt. Derimod vil aktionspotentialet-selvstændig frigivelsen (som er asynkron) generere mindre amplitude mEPSCs. Denne artikel beskriver et sæt af forsøg og analyser til at karakterisere eksistensen af synaptic mangfoldighed og omhandler de krav og begrænsninger af teknikken. Denne teknik kan anvendes til at undersøge, hvordan forskellige adfærdsmæssige, farmakologiske eller miljømæssige interventioner i vivo påvirker organisationen af synaptic kontakter i forskellige hjernen områder.
Introduction
Synaptisk transmission er en grundlæggende mekanisme for kommunikation mellem neuroner, og dermed hjernens funktion. Synaptisk transmission er også labil og kan ændre dens effekt i en aktivitet-afhængige måde så godt som reaktion på modulerende signaler1. Således har undersøgelse synaptiske funktion været et centralt fokus for neuroscience research. Hele-celle patch klemme Elektrofysiologi er en alsidig teknik, der gør det muligt for os at forstå, ved udtænke eksperimentelle design og dataanalyse, dybdegående biofysiske og molekylære mekanismer af synaptisk transmission. Et almindeligt anvendte tilgang, måske på grund af enkelheden i den teknik og koncept, er måling af miniature excitatoriske/hæmmende postsynaptiske strømme (mig / IPSCs) under spændingen klemme konfiguration2,3, 4 , 5 , 6. individuelle mPSCs repræsenterer strømmen af ioner gennem postsynaptiske ionotropic receptorer (fx AMPA og GABA-A receptorer) som svar på bindingen af deres respektive neurotransmittere frigivet fra den præsynaptiske terminal 7 . Fordi optagelsen er fremstillet i overværelse af spænding-gated Na+ kanal blokker tetrodotoxin (TTX), frigivelse er aktionspotentialet-uafhængig og indebærer normalt en enkelt synaptic vesikel, der indeholder neurotransmitter. Baseret på denne antagelse, er den gennemsnitlige amplitude af mPSCs meget udbredt som et groft estimat for quantal størrelse, som repræsenterer nummer og funktionalitet af postsynaptiske receptorer imod en enkelt udgivelse site. På den anden side anses hyppigheden af mPSCs for at repræsentere en kombination af det samlede antal synapser afslutning på den postsynaptiske celle og deres gennemsnitlige release sandsynlighed. Men disse parametre ikke måle en anden variabel-multiplicativity synapser, eller synaptic mangfoldighed — som er vigtige for effektiviteten af synaptisk transmission.
Baseret på den quantal teori om synaptisk transmission7,8,9, styrken af en given forbindelse mellem et par af neuroner er afhængig af tre faktorer: antallet af funktionelle synapser (N), den postsynaptiske reaktion på frigivelsen af en enkelt synaptic vesikel (quantal størrelse; Q) og sandsynligheden for neurotransmitter frigivelse (Pr). Synaptic multipliciteten er svarende til N. Udviklingen af synaptic mangfoldighed eller beskæring af multiplikativ synapser er plast i hele udvikling og i forskellige sygdom stater3,4,6,10. Derfor har karakteriserer synaptic mangfoldighed stor betydning for at forstå effekten af synaptisk transmission i sundhed og sygdom. Teknikker, såsom elektronmikroskopi kan identificere strukturelle beviser synaptic mangfoldighed ved at afsløre flere synaptic kontakter med oprindelse fra den samme axon på samme postsynaptiske neuron11,12, 13,14. Disse strukturelt identificerede multisynapses kan dog være funktionelt tavse15,16. Præcise funktionelle undersøgelse af N kræver teknisk udfordrende elektrofysiologiske tilgange, såsom parrede hele-celle optagelser, der kan identificere, om en given forbindelse har flere funktionelle frigivelse sites og minimal stimulation tilgange, der har til formål at rekruttere en enkelt formodede axon.
I denne protokol beskriver vi en simpel metode til vurdering af synaptic mangfoldighed ved at vedtage en metode, oprindeligt udviklet af Hsia mfl2. Denne teknik indebærer måling af spontan PSC’er (sPSCs) og mPSCs ved hjælp af hele-celle patch klemme Elektrofysiologi, som tillader os at vurdere graden af synaptic mangfoldighed på tværs af alle indgange til en given neuron. Som tidligere definerede, synaptic mangfoldighed afspejler antallet af synapser mellem en given præ- og postsynaptiske neuron. Hvis flere synapser rekrutteres i synchrony af en handling potentiale, vil der være stor sandsynlighed for temporal summation af individuelle (dvs. quantal) PSC’er, generere en større amplitude PSC. I mPSC optagelser (i hvilken handling potentialer er blokeret af TTX), sandsynligheden for temporal summation af individuelle (ikke-synkron) mPSCs er lavt. Ved hjælp af denne logik, kan synaptic mangfoldighed estimeres ved at sammenligne sPSC amplitude (med aktionspotentialet-afhængige release) til mPSC amplitude.
For at undersøge forekomsten af mangfoldighed beskrive vi fire eksperimenter og deres analyser ved hjælp af glutamatergic EPSCs som eksempel. Men samme tilgang kan bruges til hurtigt GABAergic/glycinergic transmission (IPSCs). En kort begrundelse for hvert forsøg er beskrevet nedenfor. Først, som forklaret ovenfor, synaptic mangfoldighed kan estimeres ved at sammenligne amplitude af sEPSCs til mEPSCs. Der er to krav for denne fremgangsmåde; 1) præsynaptiske axoner skal fyre et tilstrækkeligt antal handling potentialer under optagelsen, og 2) Pr skal være høj, så flere synapser frigive neurotransmitter ved ankomsten af en aktionspotentialet. For at opfylde disse krav, er sEPSCs først indspillet i lave Ca2 + kunstige cerebrospinalvæske (aCSF), og derefter optaget i overværelse af en lav koncentration af K+ kanal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) at øge handling potentielle fyring og Pr. Derefter er aktionspotentialet fyring blokeret af TTX og Pr faldt med en spænding-gated Ca2 + -kanal blokker Cd2 +. Amplituden af sEPSCs (med 4AP) er sammenlignet med mEPSC (med 4AP, TTX og Cd2 +). I det andet forsøg, er Ca2 + erstattet af equimolar Sr2 + i aCSF til desynchronize vesikel frigivelse. Som Ca2 + er påkrævede til synkron udgivelsen af vesikler, bør udskiftning med Sr2 + fjerne de store amplitude sEPSCs, der er vejledende for mangfoldighed. Tredje, mekanisk, mangfoldighed kan skyldes enten flere synaptic kontakter til samme postsynaptiske neuron eller multivesicular release (dvs. flere vesikler frigivet inden for en enkelt synaptic kontaktperson)17,18. For at skelne mellem de to typer af mangfoldighed, bruger den tredje eksperiment en lav affinitet, hurtig miljøomkostningerne konkurrencedygtige antagonist af AMPA-receptorer, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 at afgøre, om store sEPSC er resultatet af den temporal summation af uafhængige synapser eller multivesicular release handler på en overlappende befolkning af postsynaptiske receptorer. Hvis de store amplitude begivenheder opstår fra multivesicular release, bliver γ-DGG mindre effektive til at hæmme større i forhold til mindre sEPSCs, store sEPSCs, der opstår fra den temporal summation af flere synaptic kontakter vil ligeledes berøres af Γ-DGG. I den fjerde eksperiment bruges en mere fysiologiske metode til at forbedre aktionspotentialet fyring, nemlig afferente synaptic stimulation. Byger af synaptic aktivitet kan forbigående stigning/lette spontan aktionspotentialet fyring og frigivelse sandsynligheden for den stimuleret afferenter. Derfor, denne tilgang giver mangfoldighed til at manifestere i en mere fysiologisk måde.
Følgende protokol beskriver metoden til at gennemføre disse forsøg i mus hypothalamus væv. Specifikt, anvendes corticotropin frigive hormon (CRH) neuroner i paraventricular kernen i hypothalamus (PVN). Vi beskriver procedurer til at gennemføre hele-celle patch klemme Elektrofysiologi og forklare de konkrete eksperimenter til test af synaptic mangfoldighed.
Protocol
Representative Results
Discussion
En vigtig forudsætning for en vellykket patch klemme Elektrofysiologi eksperiment er at opnå sund skiver/celler. Vores beskrevne protokol er optimeret til hypothalamus skiver, der indeholder PVN neuroner. Andre hjernen områder kan kræve modificerede løsninger og udskæring metoder21,22,23,24. For optagelsen, det er afgørende at kun acceptere stabile optagelser af konstant overvågning cel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.S. modtaget Ontario Graduate stipendium. W.I. modtog en ny efterforsker stipendium fra Mental Health Research Canada. Dette arbejde støttes af driftstilskud til W.I fra naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) og det canadiske Institut for sundhedsforskning (PJT 148707).
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
References
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
- Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
- Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
- Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
- Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
- Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
- van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
- Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
- Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
- Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
- Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
- Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
- Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
- Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
- Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
- Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).
