Evaluatie van Synaptic multipliciteit met behulp van geheel-cel Patch-clamp electrofysiologie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de beoordeling van de functionele synaptic multipliciteit geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten.
Abstract
In het centrale zenuwstelsel, een paar van neuronen vaak vormen meerdere synaptic contacten en/of functionele neurotransmitter release sites (synaptic multipliciteit). Synaptic multipliciteit is plastic en veranderingen in de gehele ontwikkeling en in de verschillende fysiologische omstandigheden, wordt een belangrijke determinant voor de werkzaamheid van synaptische transmissie. We schetsen hier, experimenten voor het inschatten van de mate van multipliciteit van synapsen eindigt op een bepaalde postsynaptisch neuron geheel-cel patch klem electrofysiologie met acute hersenen segmenten. Specifiek, wordt spanning-clamp opname gebruikt voor het vergelijken van het verschil tussen de amplitude van spontane excitatory postsynaptisch stromingen (sEPSCs) en miniatuur excitatory postsynaptisch stromingen (mEPSCs). De theorie achter deze methode is dat afferent “inputs” die veelheid vertonen grote, actiepotentiaal-afhankelijke sEPSCs als gevolg van de synchrone release die bij elke synaptic contactpersoon optreedt zal tonen. Daarentegen zal de actiepotentiaal-zelfstandige release (die asynchroon is) kleinere amplitude mEPSCs genereren. Dit artikel schetst een aantal experimenten en analyses te karakteriseren van het bestaan van synaptic multipliciteit en bespreekt de vereisten en beperkingen van de techniek. Deze techniek kan worden toegepast om te onderzoeken hoe verschillende gedrags-, farmacologische of milieu interventies in vivo invloed op de organisatie van synaptic contactpersonen in verschillende hersengebieden.
Introduction
Synaptische transmissie is een fundamenteel mechanisme voor de communicatie tussen de neuronen, en vandaar, hersenfunctie. Synaptische transmissie is ook labiele en haar werkzaamheid in een activiteit-afhankelijke manier zo goed zoals in reactie op f signalen1kunt wijzigen. Behandeling van synaptische functie is dus een belangrijke focus van het onderzoek neurowetenschap. Geheel-cel patch klem electrofysiologie is een veelzijdige techniek waarmee ons te begrijpen, bedenken experimentele designs en data-analyses, diepgaande biofysische en moleculaire mechanismen van synaptische transmissie. Een veel gebruikte aanpak, misschien vanwege de eenvoud van de techniek en concept, is het meten van miniatuur excitatory/remmende postsynaptisch stromen (mE / IPSCs) onder de spanning klem configuratie2,3, 4 , 5 , 6. afzonderlijke mPSCs vertegenwoordigen de stroom van ionen via postsynaptisch ionotropic receptoren (bijvoorbeeld AMPA en GABAA -receptoren) in reactie op de binding van hun respectieve neurotransmitters vrijgesteld van de presynaptische terminal 7 . Omdat de opname wordt verkregen in de aanwezigheid van de spanning-gated nb+ kanaal blocker tetrodotoxine (TTX), de release is actiepotentiaal-onafhankelijk en normaal impliceert een één synaptic blaasje met neurotransmitters. Op basis van deze veronderstelling, wordt de gemiddelde amplitude van de mPSCs veel gebruikt als een ruwe schatting voor de grootte van quantal, waarmee het aantal en de functionaliteit van postsynaptisch receptoren tegen een enkele release-site. Aan de andere kant, wordt de frequentie van de mPSCs geacht te vertegenwoordigen een combinatie van het totale aantal synapsen tot beëindiging op de postsynaptisch cel en de waarschijnlijkheid van hun gemiddelde release. Deze parameters meten echter niet een andere variabele-multiplicativity van synapsen of synaptic multipliciteit — dat is belangrijk voor de doeltreffendheid van synaptische transmissie.
Gebaseerd op de quantal theorie van synaptische transmissie7,8,9, de sterkte van een bepaalde verbinding tussen twee neuronen is afhankelijk van drie factoren: het aantal functionele synapsen (N), de postsynaptisch reactie op de release van een enkele synaptic blaasje (quantal grootte; Q) en de waarschijnlijkheid van neurotransmitter release (Pr). Synaptic multipliciteit is gelijk aan N. De ontwikkeling van synaptic multipliciteit of de sanering van de multiplicatieve synapsen is kunststof in ontwikkeling en in andere ziekte staten3,4,6,10. Om deze reden heeft karakteriseren van synaptic multipliciteit belangrijke implicaties voor het begrijpen van de werkzaamheid van synaptische transmissie bij gezondheid en ziekte. Technieken, zoals elektronenmicroscopie kunnen structurele bewijs van synaptic multipliciteit herkennen door het detecteren van meerdere synaptic contactpersonen die afkomstig zijn uit de dezelfde axon op de dezelfde postsynaptisch neuron11,12, 13,14. Deze structureel geïdentificeerde multisynapses kunnen echter functioneel stille15,16. Precieze functionele behandeling van N meebrengt dat technisch uitdagende elektrofysiologische benaderingen, zoals gepaarde geheel-cel opnames die vaststellen kunnen of een bepaalde verbinding meerdere functionele release sites heeft en minimale stimulatie benaderingen die gericht zijn op het werven van een enkele vermeende axon.
In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode voor het schatten van synaptic multipliciteit door het aannemen van een methode die oorspronkelijk ontwikkeld door Hsia et al.2. Deze techniek omvat het meten van de spontane PSC’s (sPSCs) en mPSCs met behulp van geheel-cel patch klem electrofysiologie, waardoor we de mate van synaptic multipliciteit schatten van alle ingangen naar een bepaalde neuron. Zoals eerder omschreven, synaptic multipliciteit het aantal synapsen tussen een bepaalde pre-en postsynaptisch neuron geeft. Als meerdere synapsen worden gerekruteerd in synchronie door een actiepotentiaal, zal er een hoge waarschijnlijkheid van temporele sommatie van individuele (d.w.z. quantal) PSC, het genereren van een grotere amplitude PSC. In mPSC-opnamen (in welke actie potentials worden geblokkeerd door TTX), de waarschijnlijkheid van temporele sommatie van afzonderlijke (niet-synchrone) mPSCs is laag. Met behulp van deze grondgedachte, kan synaptic multipliciteit worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sPSC (met actiepotentiaal-afhankelijke versie) met de amplitude van de mPSC.
Onderzoek naar het bestaan van multipliciteit beschrijven we vier experimenten en hun analyses met behulp van glutamaterge EPSCs als voorbeeld. Dezelfde aanpak kan echter worden gebruikt voor de snelle toezending van de GABAergic/glycinergic (IPSCs). Een korte motivering van elk experiment wordt hieronder beschreven. Eerst, zoals hierboven uitgelegd, synaptic multipliciteit kan worden geschat door het vergelijken van de amplitude van de sEPSCs te mEPSCs. Er zijn twee vereisten voor deze aanpak; 1) presynaptische axonen moeten een voldoende aantal actie potentials brand tijdens de opname, en 2) Pr moet hoog zijn, zodat meerdere synapsen release neurotransmitter bij binnenkomst van een actiepotentiaal. Om aan deze eisen voldoen, worden sEPSCs eerst geregistreerd in lage Ca2 + kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF), en vervolgens opgenomen in de aanwezigheid van een lage concentratie van de K+ kanaal antagonist, 4-Aminopyridine (4-AP) toe actie potentiële afvuren en Pr. Actiepotentiaal afvuren wordt dan geblokkeerd door TTX en Pr daalde met een spanning-gated Ca2 + kanaal blocker Cd2 +. De amplitude van de sEPSCs (met 4AP) wordt vergeleken met die van mEPSC (met 4AP, TTX en Cd2 +). In het tweede experiment, is Ca2 + vervangen door mengsel Sr2 + in de aCSF te desynchronize blaasje release. Als Ca2 + vereist voor de synchrone release van blaasjes is, moet vervanging met Sr2 + de grote amplitude-sEPSCs die indicatief voor multipliciteit zijn elimineren. Ten derde, mechanistically, multipliciteit kan voortvloeien uit meerdere synaptic contactpersonen de dezelfde postsynaptisch neuron of multivesicular release (dat wil zeggen meerdere blaasjes vrijgegeven binnen een synaptic éénloket)17,18. Om te differentiëren tussen de twee soorten multipliciteit, het derde experiment maakt gebruik van een lage affiniteit, snelle distantieert concurrerende antagonist van AMPA receptoren, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , om te bepalen of grote sEPSC zijn het resultaat van de temporele sommatie van onafhankelijke synapsen of multivesicular release op een overlappende bevolking van postsynaptisch receptoren. Als de grote amplitude gebeurtenissen ontstaan uit multivesicular release, zullen γ-DGG minder effectief op remming van de grotere ten opzichte van kleinere sEPSCs, overwegende dat de grote sEPSCs die uit de tijdelijke sommatie van meerdere synaptic contactpersonen voortvloeien op dezelfde manier zal worden beïnvloed door Γ-DGG. In het vierde experiment, wordt een meer fysiologische methode gebruikt ter verbetering van de actiepotentiaal afvuren, namelijk afferent synaptic stimulatie. Uitbarstingen van synaptic activiteit kunnen Transient verhoging/vergemakkelijken de spontane actiepotentiaal afvuren en release kans de afferents gestimuleerd. Deze benadering biedt daarom multipliciteit om in een meer fysiologische manier te manifesteren.
Het volgende protocol beschrijft de methode voor het uitvoeren van deze experimenten in muis hypothalame weefsel. In het bijzonder worden corticotropin releasing hormoon (CRH) neuronen van de kern van de paraventricular van de hypothalamus (PVN) gebruikt. We beschrijven de procedures voor het uitvoeren van geheel-cel patch klem elektrofysiologie en de specifieke experimenten om te testen voor synaptic multipliciteit te verklaren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een belangrijke voorwaarde voor een succesvolle patch klem electrofysiologie experiment is het verkrijgen van gezonde segmenten/cellen. Ons beschreven protocol is geoptimaliseerd voor hypothalame segmenten die PVN neuronen bevatten. Andere hersenen gebieden mogelijk bewerkt oplossingen en snijden methoden21,22,23,24. Voor de opname, het is van cruciaal belang alleen te aanvaarden stabiele opnam…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.S. ontving Ontario Graduate beurs. Wi ontving een nieuwe detective Fellowship van geestelijke gezondheidsonderzoek Canada. Dit werk wordt ondersteund door de exploitatiesubsidies aan W.I van de natuurwetenschappen, Engineering Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) en de Canadian Institute voor gezondheidsonderzoek (PJT 148707).
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
References
- Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
- Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
- Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527 (1997).
- Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
- Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
- Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
- Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
- Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689 (2012).
- van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
- Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
- Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
- Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
- Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
- Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
- Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
- Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
- Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
- Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
- Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
- Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
- Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107 (2017).
