전기 생리학 전체 셀 패치 클램프를 사용 하 여 시 냅 스 다양성의 평가
Summary
여기, 선물이 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 기능 시 냅 스 다양성을 평가 하기 위한 프로토콜.
Abstract
중앙 신경 조직에서 뉴런의 쌍 종종 여러 개의 시 냅 스 연락처 및/또는 기능 신경 전달 물질 방출 사이트 (synaptic 다양성)를 형성 한다. 시 냅 스 다 플라스틱 이며 개발에 걸쳐 변화와 다른 생리 적인 조건에서 시 냅 시스 전송의 효능에 대 한 중요 한 결정 되 고. 여기, 우리는 실험 종료 급성 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 사용 하 여 주어진된 postsynaptic 신경에 시 냅 스의 복합성의 정도 추정에 대 한 개요. 특히, 전압 클램프 녹음 자발적인 흥분 성의 postsynaptic 전류 (sEPSCs)의 진폭 및 미니어처 흥분 성의 postsynaptic 전류 (mEPSCs)의 차이 비교 하는 데 사용 됩니다. 이 방법의 뒤에 이론은 이다 다양성을 전시 하는 구심 성 입력 큰, 활동 전위 종속 sEPSCs 각 시 냅 스 접촉에서 발생 하는 동기식 릴리스 때문에 표시 됩니다. 반면에, 활동 전위 독립적인 릴리스 (비동기) 인 작은 진폭 mEPSCs를 생성 합니다. 이 문서는 실험 및 분석 시 냅 스 다양성의 존재의 특성의 집합을 설명 하 고 요구 사항 및 기술의 한계에 설명 합니다. 이 기술은 vivo 영향 서로 다른 뇌 영역에 시 냅 스 연락처의 조직에에서 어떻게 다른 행동, 약리학 또는 환경적 개입 조사에 적용할 수 있습니다.
Introduction
시 냅 스 전송 뉴런 간의 통신에 대 한 근본적인 메커니즘 이며 따라서, 두뇌 기능. 시 냅 스 전송 또한 불안정 하 고 방식 활동-종속 뿐만 modulatory 신호1응답에서 그 효능을 변경할 수 있습니다. 따라서, 시 냅 스 기능 검사 신경 과학 연구의 주요 초점 되었습니다. 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학 있도록 고안 실험적인 디자인 및 데이터 분석, 시 냅 시스 전송의 깊이 있는 생물 및 분자 메커니즘을 이해 하는 다양 한 기술입니다. 일반적으로 사용 되, 아마도 때문에 기술과 개념의 단순 방식은 미니어처 흥분 성의/금지 postsynaptic 전류 측정 (나 / Ipsc) 전압 아래 클램프 구성2,3, 4 , 5 , 6. 개별 mPSCs 연 접 터미널 7에서에서 발표 했다 그들의 각각 신경 전달 물질의 바인딩에 응 postsynaptic ionotropic 수용 체 (예: AMPA 및 GABAA 수용 체)를 통해 이온의 흐름을 나타내는 . 전압 개폐 나+ 채널 차단제 테트로도톡신 (TTX) 존재 녹음을 얻을 있기 때문에 릴리스 활동 전위 독립적 이며 일반적으로 신경 전달 물질을 포함 하는 단일 시 냅 스 소포를 포함 한다. 이 가정에 기초를 두어, mPSCs의 평균 진폭 널리 이용 된다 원유 견적으로 수와 단일 릴리스 사이트를 반대 하는 postsynaptic 수용 체의 기능을 나타내는 quantal 크기에 대 한. 다른 한편으로, mPSCs의 주파수 대표 postsynaptic 세포 그리고 그들의 평균 출시 확률에 종료 시 냅 스의 총 수의 조합으로 간주 됩니다. 그러나, 이러한 매개 변수는 시 냅 스, 또는 시 냅 스 다양성의 또 다른 변수 multiplicativity 측정 하지 않습니다-시 냅 시스 전송의 효능에 대 한 중요 하다.
시 냅 스 전송7,,89의 quantal 이론에 따라, 신경 세포의 쌍 사이 지정된 된 연결의 힘은 세 가지 요소에 따라 달라 집니다: 기능 시 냅 스 (N)의 수는 단일 시 냅 스 소포 (quantal 크기;의 출시에 postsynaptic 응답 Q)와 신경 전달 물질 방출 (Pr)의 확률. 시 냅 스 다양성은 n과 같습니다. 시 냅 스 다양성의 개발 또는 곱셈 시 냅 스의 가지 치기는 플라스틱 개발에 걸쳐 및 다른 질병 국가3,4,,610에. 이러한 이유로, 건강 및 질병에 시 냅 시스 전송의 효능을 이해 하기 위한 중요 한 의미는 다양성을 시 냅 스 특성화. 기법, 전자 현미경 등 여러 시 냅 스 연락처는 동일한 postsynaptic 신경11,12, 이전에 동일한 축 삭에서 발생을 감지 하 여 다양성을 시 냅 스의 구조적 증거를 확인할 수 있습니다. 13,14. 그러나, 이러한 구조적으로 확인 된 multisynapses 기능 자동15,16수 있습니다. N 의 정확한 기능 시험 주어진된 연결에 여러 기능 릴리스 사이트를 식별할 수 있는 짝된 전체 셀 녹음 등 electrophysiological 방법을 기술적으로 도전적인 필요 최소한의 단일 putative 축 삭을 모집을 목표로 하는 자극 접근.
이 프로토콜에서 우리 Hsia 외2에 의해 원래 개발 방법을 채택 하 여 시 냅 스 다양성을 추정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다. 이 기술은 자연 Psc (sPSCs) 및 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학, 특정된 뉴런에 대 한 모든 입력에 걸쳐 시냅틱 복합성의 정도 예측할 수 있는 사용 하 여 mPSCs의 측정을 포함 한다. 로 이전에 정의 된, 시 냅 스 다양성 주어진된 사전 및 postsynaptic 신경 세포 사이의 시 냅 스의 수를 반영 합니다. 여러 개의 시 냅 스는 활동 전위에 의해 synchrony에서 모집 하 고, 큰 진폭 PSC를 생성 하는 개별 (즉, quantal) Psc의 일시적인 합계의 확률이 매우 높은 있을 것입니다. MPSC 기록에서 (에 있는 활동 전위는에 의해 차단 TTX), 개인 (비 동기) mPSCs의 일시적인 합계의 확률은 낮습니다. 이 논리를 사용 하 여, 시 냅 스 다양성 sPSC 진폭 (활동 전위 종속 자료)와 mPSC 진폭을 비교 하 여 추정 수 있습니다.
다중성의 존재를 검사 4 개의 실험 및 예를 들어 glutamatergic EPSCs를 사용 하 여 그들의 분석을 설명 합니다. 그러나, 동일한 접근 방식을 사용할 수 있습니다 빠른 GABAergic/glycinergic 전송 (Ipsc). 각 실험에 대 한 간략 한 근거 아래 설명 되어 있습니다. 첫째, 위에서 설명한 mEPSCs에 sEPSCs의 진폭을 비교 하 여 시 냅 스 다를 추정 수 있습니다. 이 접근;에 대 한 두 가지 요구 사항이 있습니다. 1) 연 접 축 삭 한다 활동 전위의 충분 한 수 기록, 중 고 2) Pr 수 있어야 합니다 높은 여러 시 냅 스 신경 활동 전위의 도착 시 해제. 이러한 요구 사항을 충족, sEPSCs는 낮은 Ca2 + 인공 뇌 척수 (실제)에 처음 기록 된 고 K+ 채널 길 항 제, 행동 증가 4-Aminopyridine (4-AP)의 낮은 농도의 기록 잠재적인 발사 하 고 Pr. 다음 발사 하는 활동 전위는 TTX 및 홍보 전압-문이 캘리포니아2 + 채널 차단 Cd2 +감소에 의해 차단 됩니다. MEPSC의 sEPSCs (4AP)와 비교 (4AP, TTX와 Cd2 +). 두 번째 실험에서 캘리포니아2 + 아데닌 Sr2 + 기 출시 desynchronize를 실제에 의해 대체 됩니다. 캘리포니아2 + vesicles의 동기 릴리스에 대 한 필요는, Sr2 + 교체 다양성을 나타내는 큰 진폭 sEPSCs를 제거 한다. 셋째, mechanistically, 다양성에 발생할 수 있습니다 여러 개의 시 냅 스 연락처 중에서 동일한 postsynaptic 신경 또는 multivesicular 릴리스 (즉, 단일 시 냅 스 접촉 내 발표는 여러 vesicles)17,18. 다양성의 두 종류를 구분 하는 세 번째 실험 사용 하 여 낮은 선호도, 빠른 출신과 경쟁 길 항 근 AMPA 수용 체, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,의18 큰 있는지 여부를 확인 하 sEPSC 독립 시 냅 스의 multivesicular 릴리스 postsynaptic 수용 체의 겹치는 인구에 일시적인 합계의 결과입니다. 큰 진폭 이벤트 multivesicular 방출에서 발생 하는 경우 γ-DGG 효과가 있을 것입니다 덜 큰 작은에 비해 sEPSCs 억제에 큰 sEPSCs 여러 개의 시 냅 스 연락처의 일시적인 합계에서 발생 하는 것입니다 마찬가지로 영향을 받을 반면 Γ-DGG입니다. 4 실험에서 더 생리 메서드는 활동 전위 발사, 즉 입성 시 냅 시스 자극을 향상 시키기 위해 사용 됩니다. 시 냅 스 활동의 파열 수 뚜렷이 증가/촉진 자극된 afferents의 자발적인 활동 전위 발생 및 릴리스 확률. 따라서,이 이렇게 다양성이 더 생리 적인 방법으로 매니 페스트 수 있습니다.
다음 프로토콜 마우스 hypothalamic 조직에 이러한 실험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 특히, corticotropin 공개 호르몬 (CRH) 신경 시상 하 부 (PVN)의 paraventricular 핵의 사용 됩니다. 우리는 전체 셀 패치 클램프 전기 생리학을 실시 하기 위한 절차를 설명 하 고 시냅틱 다양성에 대 한 테스트를 특정 실험을 설명.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적인 패치 클램프 전기 생리학 실험에 대 한 한 가지 중요 한 요구 건강 한 조각/셀을 얻는 이다. 우리의 설명된 프로토콜 hypothalamic 조각 PVN의 뉴런을 포함 하는 최적화 되어 있습니다. 다른 뇌 영역 해야 수정 솔루션 및 조각화 방법21,22,,2324. 기록, 그것은 막 저항 등 셀 속성을 지속적으로 모니터?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
제는 온타리오 대학원 장학금을 받았다. W.I. 정신 건강 연구의 캐나다에서 새로운 탐정 친교를 받았다. 이 작품은 건강 연구 (PJT 148707) 자연과학 및 공학 연구 위원회의 캐나다 (06106-2015 RGPIN)와 캐나다 연구소에서 W.I 보조금 운영 지원.
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
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