Voorbereiding en toepassing van een nieuwe bacteriële biosensor voor de vermoedelijke detectie van schot residu

Summary

Een protocol wordt gepresenteerd met behulp van synthetische biologietechnieken om een set van bacteriële biosensoren voor de analyse van schot residu te synthetiseren, en om de werking van de apparaten te testen voor het beoogde gebruik met behulp van fluorescentiespectroscopie.

Abstract

MicRoboCop is een biosensor die is ontworpen voor een unieke toepassing in de forensische Chemie. MicRoboCop is een systeem bestaande uit drie apparaten die, wanneer samen gebruikt, kan de aanwezigheid van schot residu (GSR) te geven door het produceren van een fluorescentie signaal in de aanwezigheid van drie belangrijke analyten (antimoon, lood, en organische componenten van GSR). Het protocol beschrijft de synthese van de biosensoren met behulp van Escherichia coli (E. coli), en de analytische chemie methoden die worden gebruikt om de selectiviteit en de gevoeligheid van de sensoren te evalueren. De werking van het systeem wordt aangetoond door het gebruik van GSR verzameld van de binnenkant van een gebruikte cartridge behuizing. Eenmaal voorbereid, kunnen de biosensoren worden opgeslagen tot ze nodig zijn en kunnen worden gebruikt als een test voor deze belangrijke analyten. Een positieve reactie van alle drie de analyten biedt een vermoedelijke positieve test voor GSR, terwijl elk afzonderlijk apparaat toepassingen heeft voor het opsporen van de analyten in andere monsters (bijv. een detector voor lood contaminatie in drinkwater). De belangrijkste beperking van het systeem is de tijd die nodig is voor een positief signaal; toekomstige werkzaamheden kunnen betrekken het bestuderen van verschillende organismen om de responstijd te optimaliseren.

Introduction

Een biosensor is een analytisch apparaat dat gebruikmaakt van biologische componenten (zoals eiwitten, nucleïnezuren of hele organismen) die een reactie produceren die kan worden gebruikt voor het opsporen van een chemische stof of analyt. Als voorbeeld, de kolenmijn industrie gebruikt een biosensor voor een groot deel van de 20^e eeuw om de aanwezigheid van giftige mijn gassen te detecteren: de kanarie in de kolenmijn¹. De (de) reactie van het biologische organisme (de dood of de nood) aan een chemische analyt (koolmonoxide) werd waargenomen door de mijnwerkers om de arbeiders te beschermen. In een meer moderne en verfijnde voorbeeld, bacteriën kunnen worden veranderd met behulp van synthetische biologietechnieken om te reageren op de aanwezigheid van een bepaalde chemische analyt door het tentoonstellen van een specifieke reactie, zoals de expressie van een fluorescerende eiwit.

Synthetische biologie is een brede term die verwijst naar de bouw van biologische apparaten en systemen die niet van nature bestaan, of het herontwerp van bestaande biologische systemen voor een specifiek doel². Synthetische biologie onderscheidt zich van genetische manipulatie door een standaard methodologie en het bestaan van gestandaardiseerde onderdelen (standaard synthetische biologie genetische elementen) die kunnen worden gebruikt om apparaten en systemente synthetiseren. Een deel wordt geïntroduceerd in het genoom van een apparaat, een organisme zoals een bacterie, om een bepaalde eigenschap uit te drukken die als aanwijzing van functie zal dienen. Bijvoorbeeld, in vele synthetische apparaten, wordt de uitdrukking van een fluorescente proteïne geïntroduceerd in één eencellige organisme als verslaggever proteïne. Meerdere apparaten kunnen worden gecombineerd in een systeem. Het genoom van micro-organismen zoals bacteriën zijn gemakkelijk te manipuleren op deze manier. Talrijke voorbeelden van biosensoren die specifiek zijn voor een breed scala van chemische analyten zijn gerapporteerd in de literatuur over de laatste tien jaar^3,4.

In dit werk wordt het MicRoboCop systeem gepresenteerd als een voorbeeld van een biosensor ontworpen met behulp van synthetische biologietechnieken met nieuwe toepassingen in de forensische en milieu-chemie. MicRoboCop is een systeem van drie afzonderlijke apparaten die, wanneer gecombineerd, zal Escherichia coli om rode fluorescerende eiwit (offerte) uit te drukken in de aanwezigheid van schot residu (GSR) die is verzameld uit handen van een persoon of een oppervlak. Elk van de drie apparaten reageert op een specifieke chemische analyt waarvan bekend is dat het een onderdeel van GSR⁵. De drie analyten waarop het systeem reageert zijn I. 2, 4, 6-trinitrotolueen (TNT) en aanverwante verbindingen, II. lood (in de vorm van lood ionen), en III. Antimoon (ook in de vorm van ionen).

GSR bestaat uit veel verschillende chemische stoffen, maar de drie meestal gebruikt om een residu te identificeren als GSR zijn barium, lood, en antimoon⁵. De standaard evidentiary test voor de identificatie van GSR is het gebruik van Scanning Electron microscopie (SEM) met energie Dispersive X-Ray fluorescentie (EDX)⁵. SEM-EDX staat analisten toe om de unieke morfologie en de elementaire componenten van GSR te identificeren. Momenteel zijn er weinig gebruikte binaire vermoedelijke tests beschikbaar. Een onlangs gepubliceerde vermoedelijke test maakt gebruik van Ion-Mobility spectroscopie (IMS), dat is gespecialiseerd apparatuur die misschien niet beschikbaar zijn in vele Labs⁶. Er zijn ook een paar kleur “spot” tests die kunnen worden gebruikt, hoewel ze meestal worden gebruikt voor afstand bepaling of voor GSR identificatie op kogelgaten en wonden⁵. Bovendien, er is enige beperkte aandacht in de literatuur aan elektrochemische tests voor GSR die voltammetric analyse, die het voordeel van potentieel wordt gebied draagbare, of anodische strippen voltammetry, dat is een uiterst gevoelige methode voor metallic elementen⁷. Er is zeer weinig vermelding in de literatuur van biosensoren speciaal ontworpen voor het doel van het opsporen van GSR, hoewel sommige biosensoren voor andere forensische toepassingen zijn gepubliceerd⁸.

De biologische elementen voor elk apparaat in het MicRoboCop systeem, en de plasmide constructie, worden geïllustreerd in Figuur 1. De gebogen pijl in Figuur 1b vertegenwoordigt de promotor regio die wordt geactiveerd in de aanwezigheid van de analyt, de ovaal is de ribosomale bindende site die het mogelijk maakt de vertaling van de verslaggever eiwit, de grijze doos met het label offerte is het gen dat rood uitdrukt fluorescerende eiwitten, en de rode Octagon is de transcriptie beëindiging site. Alle drie de apparaten zullen samen worden gebruikt als een systeem om GSR te detecteren. Elk apparaat met een specifieke promotor (SbRFP, PbRFP, en TNT-offerte) zal worden uitgebroed met het monster dat wordt getest en fluorescentie van offerte zal worden gemeten. OFFERTE zal alleen worden uitgedrukt als de juiste chemische analyt aanwezig is en de promotor regio activeert. Drie apparaten die reageren op een aantal van de chemische stoffen die aanwezig zijn in GSR zijn ontworpen en worden gepresenteerd in dit werk.

De promotors gebruikt in de drie MicRoboCop apparaten zijn een arseen en antimoon Sensitive promotor , SbRFP⁹,¹⁰, een lead Sensitive promotor, PbRFP^11,12 en een TNT Sensitive promotor, TNT-offerte ¹³. omdat een zoekopdracht in de literatuur geen promotor ontwierp om te reageren op barium, werd de TNT promotor in plaats daarvan geselecteerd omdat deze promotor gevoelig is voor een aantal structureel verwante verbindingen (met name 2, 4-dinitrotoluene en dinitrobenzeen) waarvan bekend is dat ze deel uitmaken van de organische verbindingen die achterblijven in GSR. Deze promotor is met succes gebruikt om de minieme hoeveelheden TNT en dinitrotoluene (2, 4-DNT) in begraven landmijnen¹³specifiek te ontdekken. Met behulp van de drie apparaten samen als een systeem, een positieve test voor GSR zal produceren fluorescentie in alle drie de apparaten. Een fluorescentie signaal in slechts één of twee apparaten zal een andere milieu bron van de analyt (en) of in het geval van de promotor van TNT aangeven, activering door een verbinding die geen organische samenstelling is die achter in GSR wordt verlaten. Door alle drie de apparaten samen te gebruiken, wordt de mogelijkheid van een vals positieve resultaten toe te schrijven aan milieubronnen geminimaliseerd. Loodvrije munitie, die in populariteit wint, vertegenwoordigt nog slechts ongeveer 5% van de munitie verkoop in de Verenigde Staten; Vandaar, kunnen de valse negatieve resultaten toe te schrijven aan de afwezigheid van lood een mogelijkheid zijn maar er is nog nut in een sensor die lood als teller voor GSR¹⁴gebruikt. In aanvulling op deze specifieke forensische toepassing, kan elk apparaat afzonderlijk worden gebruikt voor het opsporen van milieuverontreinigingen.

De gepresenteerde protocollen omvatten de synthetische biologietechnieken gebruikt om de apparaten te maken (sensor bacteriën) en de analytische technieken om de functie van de apparaten te controleren en analyseren van de fluorescentie signalen verkregen. Het protocol omvat ook de verzameling van forensisch bewijs in de vorm van de hand af te vegen om GSR te verzamelen uit de handen van een verdachte of zwabberen om GSR te verzamelen van een oppervlak. Resultaten van de lead sensor apparaat worden gepresenteerd als voorbeeld resultaten, samen met een demonstratie van een positieve test voor GSR met behulp van een gebruikte cartridge behuizing.

Protocol

Nota: de synthese van E. coli die offerte uitdrukt wordt voorgesteld. 1. voorbereiding van plasmide DNA van E. coli Dooi e. coli bevattend een plasmide met een gen van de offerte en het bestand van de weerstand AMPICILLIN en kweken e. coli op Luria Bouillon (lb) agar platen die 100 µ g/ml AMPICILLIN bij 37 °c voor 24 h bevatten. Gebruik bijvoorbeeld de J10060 plasmide uit het register van standaard biologische onderdelen die worden gebruikt voor …

Representative Results

Fluorescentie Spectra voor de in dit werk gebruikte offerte variant worden weergegeven in Figuur 2. Deze gegevens zijn afkomstig van het PbRFP-apparaat als het reageert op lead en de TNT-offerte apparaat als het reageert op twee analyten, 2, 4-DNT en 1, 3-DNB. Dit cijfer toont het spectrum van een negatieve controle (geen analyt toegevoegd), en de spectra op twee verschillende niveaus van analyt toegevoegd. Het maximum fluorescentie signaal voor de gebruikte offerte varia…

Discussion

Wijzigingen en probleemoplossing

Het in tabel 4 beschreven experiment kan op welke manier dan ook aangepast worden aan de ontworpen sensoren. Het belangrijkste aspect van een chemische sensor is het evalueren van de gevoeligheid en specificiteit. Het is nuttig om ervoor te zorgen dat een breed scala van concentraties van de analyt wordt geanalyseerd om de nuttige analytische bereik van de sensor te bepalen. Het is ook de moeite waard het bepalen van een maximu…

Materials

1,3-dinitrobenzene, 97%	Aldrich	D194255-25G
2,4-dinitrotoluene, 97%	Aldrich	101397-5G
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
Antimony, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SA450-100	Standard in dilute HNO3
Cut Smart Buffer	New England BioLabs	B7204S
Duplex Buffer	Integrated DNA Technologies	11-01-03-00
EcoRI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3101S
Ethanol, HPLC grade, denatured	Acros Organics	AC611050040	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
Eurofins Genomics SimpleSeq DNA Sequencing Kits	Eurofins Genomics	SimpleSeq Kit Standard
Forward primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCATATAT-3’
Forward primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GTAAAACGACGGCCAGTG-3’
IBI Science High Speed Plasmid Mini-kit	IBI Scientific	IB47101
LB Broth, Miller	Fisher Scientific	BP1426-500
Lead, Reference Standard Solution (1000ppm ±1%/Certified)	Fisher Scientific	SL21-100	Standard in dilute HNO3
LeadOff Disposable Cleaning and Decon Wipes	Hygenall	45NRCN	Sold in canisters or individually wrapped, any alcohol based wipe will work.
Methanol, HPLC grade	Fisher Scientific	A452-4	Solvents do not need to be HPLC grade, ACS or reagent grade will work.
NEB 5-alpha Competent E. coli cells	New England BioLabs	C2987I
NheI-HF Restriction Enzyme	New England BioLabs	R3131S
Nuclease free water	New England BioLabs	B1500S
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer	New England BioLabs	M0482S
Plasmids from the registry of standard biological parts used for synthetic biology	Registry of Standard Biological Parts		http://parts.igem.org/Main_Page
Promoter Sequences	Integrated DNA Technologies		Sb promoter: 5’-GCATGAATTCAGTCAT ATATGTTTTTGACTTATCCGCTTCGAAGAGAG AGACACTACCTGCAACAATCGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCTCACTATATACAAAAACT GAATAGGCGAAGCTTCTCTCTCTGTGATGGAC GTTGTTAGCGATCGCGTA-5’ Pb promoter: 5’-GCATGAATTCGTCTTG ACTCTATAGTAACTAAGGGTGTATAATCGGCA ACGCGAGCTAGCGCAT-3’ 3’-CGTACTTAAGCAGAACTGAGATATCATTG ATCTCCCACATCTTAGCCGTTGCGCTGCGATCGCGTA-5’ TNT promoter: 5’GCATTCTAGATCAATT TATTTGAACAAGGCGGTCAATTCTCTTCGATT TTATCTCTCGTAAAAAAACGTGATACTCATCA CATCGACGAAACAACGTCACTTATACAAAAAT CACCTGCGAGAGATTAATTGAATTCGCAT3’ 3’CGTAAGATCTAGTTAAATAAACTTGTTCCG CCAGTTAAGAGAAGCTAAAATAGAGAGCATTT TTTTGCACTATGAGTAGTGTAGCTGCTTTGTT GCAGTGAATATGTTTTTAGTGGACGCTCTCTA ATTAACTTAAGCGTA5’
Reverse primer for colony PCR	Integrated DNA Technologies		5’- GCCGCTTGAATTCGTCTAGACT- 3’
Reverse primer for DNA sequencing	Integrated DNA Technologies		5’- GGAAACAGCTATGACCATG-3’
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202S