Combinando analisi SDS-PAGE non riducenti e reticolazione chimica per rilevare complessi multimerici stabilizzati dai legami disolfuro nelle cellule di mammiferi nella cultura

Summary

I legami disolfuro sono stati a lungo conosciuti per stabilizzare la struttura di molte proteine. Un metodo semplice per analizzare complessi multimerici stabilizzati da questi legami è attraverso l’analisi di SDS-PAGE non-riduzione. Qui, questo metodo è illustrato analizzando l’isoforma nucleare di dUTPase dalla linea cellulare osteosarcoma dell’osso umano U-2 OS.

Abstract

Le strutture di molte proteine sono stabilizzate attraverso legami di disolfuro covalenti. Nel recente lavoro, questo legame è stato anche classificato come una modifica post-traduzionale. Così, è importante essere in grado di studiare questa modifica nelle cellule viventi. Un metodo semplice per analizzare questi complessi multimerici stabilizzati con cisteina è attraverso un metodo a due fasi di analisi SDS-PAGE non-riduzione e cross-linking di formaldeide. Questo metodo a due fasi è vantaggioso come il primo passo per scoprire complessi multimerici stabilizzati da legami disolfuro a causa della sua facilità tecnica e basso costo di funzionamento. Qui, la linea cellulare di osteosarcoma osseo umano U-2 OS viene utilizzata per illustrare questo metodo analizzando specificamente l’isoforma nucleare di dUTPase.

Introduction

I legami disolfuro sono stati a lungo conosciuti per stabilizzare la struttura di molte proteine. Nel recente lavoro, questo legame è stato anche classificato come una modifica post-traslazionale reversibile, agendo come un “interruttore redox” a base di cisteina che consente la modulazione della funzione proteica, la posizione e l’interazione^{1,2, 3,4}. Pertanto, è importante essere in grado di studiare questa modifica. Un metodo semplice per analizzare questi complessi multimerici stabilizzati con cisteina è attraverso l’analisi non-riduzione SDS-PAGE⁵. L’analisi SDS-PAGE è una tecnica utilizzata in molti laboratori, dove i risultati possono essere ottenuti e interpretati in modo rapido, semplice e con costi minimi, ed è vantaggioso rispetto ad altre tecniche utilizzate per identificare i legami disolfuro come la spettrometria di massa^{6 ,7} e dicroismo circolare⁸.

Un passo importante nel determinare se questo metodo è una tecnica appropriata per aiutare in uno studio è quello di esaminare accuratamente la sequenza primaria della proteina di interesse per assicurare che ci sono residui di cisteina (s) presenti. Un altro passo utile è quello di ricercare le precedenti strutture cristalline pubblicate o utilizzare un’applicazione bioinformatica per esplorare la struttura tridimensionale della proteina di interesse per visualizzare dove possono essere localizzati i residui di cisteina. Se il residuo (s) è presente sulla superficie esterna può essere un candidato migliore per formare un legame disolfuro piuttosto che un residuo di cisteina sepolto all’interno della struttura. Tuttavia, è importante notare che le proteine possono subire cambiamenti strutturali sulle interazioni del substrato o sulle interazioni proteina-proteina permettendo che questi residui diventino poi esposti anche all’ambiente.

I complessi multimerici identificati possono quindi essere verificati con il cross-linking chimico usando la formaldeide. La formaldeide è un cross-linker ideale per questa tecnica di verifica a causa dell’elevata permeabilità alle cellule e della breve estensione di ~ 2-3 Å, assicurando il rilevamento di interazioni proteina-proteina specifiche^9,10. Qui, questo metodo è illustrato analizzando l’isoforma nucleare di dUTPase dalla linea cellulare osteosarcoma ossea umana U-2 OS¹¹. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per altre linee cellulari, tessuti e organismi.

Protocol

1. blocco dei residui di cisteina liberi utilizzando iodoacetamide Crescere le cellule U-2 OS in un 6 cm2 piatto al 50%-60% confluenza in mezzo essenziale minimo con alto glucosio contenente 10% siero bovino fetale e 1% piruvato di sodio a 37 ° c in 5% Co2. Fare un nuovo stock di 10 mM iodoacetamide appena prima dell’uso, quindi scartare il reagente non utilizzato. Aggiungere 0,1 mM di concentrazione finale iodoacetamide direttamente al supporto di coltura cellulare. D…

Representative Results

L’Dutpasi nucleare forma un legame disolfuro intermolecolare formando una configurazione di dimero stabile attraverso l’interazione di due residui di cisteina posizionati al terzo aminoacido di ogni proteina monomerica11. Ciò è dimostrato in Figura 1a, B. Per garantire che questo legame disolfuro non fosse un’interazione non specifica a causa di anomalie migratorie nell’ambiente non ridotto, l’inclusione di un contro…

Discussion

Il metodo qui delineato fornisce un protocollo diretto per l’analisi di complessi multimerici stabilizzati attraverso legami disolfuro. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre linee di coltura cellulare, tessuti e organismi che consentono una vasta gamma di applicazioni.

Un passo importante in questa procedura è quello di garantire che i legami disolfuro non sono una conseguenza della procedura di estrazione. Eventuali residui di cisteina liberi possono essere bloccati util…

Materials

16% precast TGX gels	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Flask	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2 dish	VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL detection kit	GE	16817200
Blot transfer apparatus	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Bradford protein reagent	Biorad	5000006
Bromophenol Blue
BSA	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Drill
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus	Invitrogen	A25977
Extra thick western blotting paper	ThermoFisher	88610
Fetal bovine serum	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol	Sigma Aldrich	65516
Glycine	RPI	636050
Heat block	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Hydrochloric acid	VWR	2018010431
Iodoacetamide	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Methanol	Pharmco	339000000
Non-fat dry milk	Cell signaling	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Posi-click tube	Denville	C2170
Power supply	Biorad	200120
Prestained marker	ThermoFisher	26619
PVDF membrane	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Secondary antibody	Cell signaling	70748
Small cell scraper	Tygon	S-50HL class VI
Sodium chloride	RPI	S23020
Sodium pyruvate	Gibco
Sonicator	Branson	450
Sponge pad for blotting	Invitrogen	E19051
Stir plate	Corning	PC353
Sucrose	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine running buffer	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
X-ray film	ThermoFisher	34090