非還元 SDS − PAGE 分析と化学的架橋を組み合わせて、培養中の哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合によって安定化された多量体複合体を検出する
Summary
ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。これらのリンケージによって安定化された多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析を介して行う。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS からの原発性の核アイソフォームを解析することにより図示される。
Abstract
多くのタンパク質の構造は共有性ジスルフィド結合によって安定化されます。最近の仕事では、この債券も翻訳後修飾として分類されています。このように、生細胞におけるこの修飾を研究することができることが重要である。これらのシステイン安定化多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元 SDS − PAGE 分析およびホルムアルデヒド架橋の2ステップ法を介して行う。この二段階法は、その技術的容易さと低運転コストのためにジスルフィド結合によって安定化された多量体錯体を明らかにする最初のステップとして有利である。ここで、ヒト骨骨肉腫細胞株 U-2 OS は、dUTPase の核アイソフォームを特異的に分析することによりこの方法を説明するために用いられる。
Introduction
ジスルフィド結合は長い間多くのタンパク質の構造を安定化させることが知られている。最近の仕事では、この結合はまた、可逆的な翻訳後修飾として分類されており、タンパク質機能、位置および相互作用1、2の変調を可能にするシステインベースの「レドックススイッチ」として機能し、 3、4。したがって、この変更を研究することができることが重要です。これらのシステイン安定化多量体複合体を分析する簡単な方法は、非還元性 SDS − PAGE 分析5を介して行う。SDS − PAGE 分析は、多くの実験室で用いられる技術であり、その結果は、迅速かつ容易に、かつ最小限のコストで解釈することができ、質量分析などのジスルフィド結合を同定するために使用される他の技術よりも有利である。 、7及び円形二色性8.
この方法が研究に役立つ適切な技術であるかどうかを決定するための1つの重要なステップは、関心のあるタンパク質の一次配列を徹底的に調べて、システイン残基 (複数可) が存在することを保証することである。もう一つの有用なステップは、公開またはバイオインフォマティクスアプリケーションを使用して、システイン残基 (複数可) が位置することができる場所を視覚化するために、目的のタンパク質の三次元構造を探索するために、以前の結晶構造を研究することです。残渣 (複数可) が外面上に存在する場合は、構造体の内側に埋設されたシステイン残基ではなくジスルフィド結合を形成する方が良い候補であり得る。しかしながら、タンパク質は、基質相互作用またはタンパク質-蛋白質相互作用によって、これらの残留物が環境にも暴露されるようになると構造的な変化を起こす可能性があることに注意することが重要です。
同定された多量体複合体は、ホルムアルデヒドを使用して化学架橋で検証することができます。ホルムアルデヒドは、2-3 Åの高い細胞透過性および短い架橋スパンによるこの検証技術のための理想的なクロスリンカーであり、特定のタンパク質-蛋白質相互作用の検出を確実にする9,10。ここで、この方法は、ヒト骨骨肉腫細胞株 dUTPase OS11からの原発性の核アイソフォームを解析することにより図示される。しかし、このプロトコルは、他の細胞株、組織および生物に適合させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで概説される方法は、ジスルフィド結合を介して安定化された多量体錯体の分析のためのストレートフォワードプロトコルを与える。このプロトコルは、他の細胞培養ライン、組織および生物に容易に適応することができ、広範囲の用途を可能にする。
この手順の重要なステップは、ジスルフィド結合が抽出手順の結果ではないことを確認することです。遊離シス?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、dUTPase ポリクローナル抗体の精製について、ジェニファー・フィッシャー博士が出した努力と、この原稿を編集するためのすべての努力をケリー Ciccaglione に感謝します。この研究は、部分的にニュージャージー健康財団 (グラント #PC 11-18) からの助成金によって支えられました。
Materials
| 16% precast TGX gels | ThermoFisher | Xp00160 | |
| 175 cm2 Flask | Cell star | 658175 | |
| 18CO | ATCC | CRL-1459 | |
| 6 cm2 dish | VWR | 10861-588 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Amersham ECL detection kit | GE | 16817200 | |
| Blot transfer apparatus | Biorad | 153BR76789 | |
| BME | Sigma Aldrich | M3148 | |
| Bradford protein reagent | Biorad | 5000006 | |
| Bromophenol Blue | |||
| BSA | Cell signaling | 99985 | |
| Cell lysis buffer | Cell signaling | 9803 | |
| Centrifuge | Eppendor | 5415D | |
| DMEM | Gibco | 11330-032 | |
| Drill | |||
| EDTA | Sigma Aldrich | M101 | |
| Electrophoresis apparatus | Invitrogen | A25977 | |
| Extra thick western blotting paper | ThermoFisher | 88610 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 1932693 | |
| Formaldehyde | ThermoFisher | 28908 | |
| Glass-teflon homogenizer | |||
| Glycerol | Sigma Aldrich | 65516 | |
| Glycine | RPI | 636050 | |
| Heat block | Denville | 10285-D | |
| Hepes | Sigma Aldrich | H0527 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 2018010431 | |
| Iodoacetamide | ThermoFisher | 90034 | |
| Kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| Methanol | Pharmco | 339000000 | |
| Non-fat dry milk | Cell signaling | 99995 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P3813 | |
| PMSF | Sigma Aldrich | 329-98-6 | |
| Posi-click tube | Denville | C2170 | |
| Power supply | Biorad | 200120 | |
| Prestained marker | ThermoFisher | 26619 | |
| PVDF membrane | Biorad | 162-0177 | |
| Rocker | Reliable Scientific | 55 | |
| Saos2 | ATCC | HTB-85 | |
| SDS | Biorad | 161-0302 | |
| Secondary antibody | Cell signaling | 70748 | |
| Small cell scraper | Tygon | S-50HL class VI | |
| Sodium chloride | RPI | S23020 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | ||
| Sonicator | Branson | 450 | |
| Sponge pad for blotting | Invitrogen | E19051 | |
| Stir plate | Corning | PC353 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S-1888 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tris Buffered Saline, with Tween 20, pH 7.5 | Sigma Aldrich | SRE0031 | |
| Tris-Glycine running buffer | VWR | J61006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| U-2 OS | ATCC | HTB-96 | |
| X-ray film | ThermoFisher | 34090 |
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