하 악 및 파 타 액 땀 샘에서 유기 유형 배양의 방사선 치료는 생체 내 특성의 핵심

Summary

3 차원 유기 typic 문화권을 사용 하 여 타 액 선의 형태학 및 기능적인 마커를 시각화 하는 것은 방사선을 따르는 조직 손상의 기계 장치에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서 설명 하는 프로토콜은 이온화 방사선에 노출 되기 전에 섹션, 문화, 방사선, 얼룩 및 이미지 50-90 μ m 두께의 타 액 선 섹션에 관한 것 이다.

Abstract

Xerostomia는 방사선 요법으로 치료 되는 머리와 목 암 환자에 있는 삶의 질을 감소 시키는 만성 경구 합병증을 만듭니다. 타 액 선 기능 장애 및 복원의 이해 메커니즘에 대 한 실험적 접근법은 생체 내 모델에 초점을 맞추고 있으며,이는 형질 감염의 치료 후보 및 효율성을 체계적으로 화면 화 하는 무 능력에 의해 장애인 특정 유전자를 조작 하는 기능. 이 침 샘 유기 typic 배양 프로토콜의 목적은 배양 생존 율의 최대 시간을 평가 하 고 전 생체 방사선 치료 후 세포 변화를 특성화 하는 것입니다. 우리는 면역 형광 염색 및 공초점 현미경을 이용 하 여 특정 세포 집단 및 마커가 30 일 배양 기간 동안 존재 하는 시기를 결정 합니다. 또한, 이전에 생체 내 방사선 모델에서 보고 된 세포 마커는 생체 내 조사 되는 배양 물에서 평가 된다. 전진 하는이 방법은 침 샘 기능을 개선 하는 치료제에 대 한 뮤 린 및 인간 타 액 선 조직 반응의 신속한 ex 생체 내 평가를 위한 매력적인 플랫폼입니다.

Introduction

적절 한 타 액 선 기능은 구강 건강에 필수적 이며 방사선 요법으로 머리와 목 암 치료 다음에 변경 됩니다¹. 2017에서, 머리와 목 암의 거의 5만 새로운 케이스는 미국에서 보고 되었다². 침 샘과 같은 주변 정상 조직에 대 한 방사선 요법의 조직 손상 및 자주 돌이킬 수 없는 효과로 인해, 환자는 종종 심각한 부작용으로 남아 있고 삶의 질을 감소^{2,3, 4}. 방사선 손상으로 인 한 일반적인 합병증은 xerostomia (구강 건조의 주관적인 느낌), 치아 우 식, 씹는 것과 삼 킴, 음성 장애 및 손상 된 경구 마이크로 바이오 메스² 와 같은 증상에서 나타난다 ^{3 , 4}.이 현상은 집단적으로 영향 받은 개별에 있는 영양실조 그리고 손상 한 생존에 지도할 수 있습니다⁵. 이 인구의 침 샘 기능 장애는 잘 문서화 되었지만, 포상 세포에 대 한 손상의 근본적인 기전이 논란이 되었으며, 다른 동물 모델 들 사이에는 약간의 통합이 있다^6,7.

침 샘 기능 및 방사선 유발 손상 연구의 현재 방법은 생체 내 모델의 사용을 포함, 불멸의 세포 주, 2 차원 (2-d) 일차 세포 배양 물 및 3 차원 (3-d) 살 리 구 균 배양 물^{8, 10},¹¹,¹². 전통적으로, 불멸의 세포 라인과 2 차원 배양에서 세포 배양 모델은 평평한 표면에 배양 된 단일 층 세포를 포함 하 고 빠르고, 쉽고, 비용 효율적인 실험에 대 한 가치가 있다. 그러나, 인공 세포 배양 조건은 다양 한 조건에 노출 된 세포의 분화 상태 및 생리 적 반응을 변화 시킬 수 있으며, 그 결과는 종종 전체 유기 체 모델^14,15로의 번역에 실패 하 게 된다. 또한, 불멸 세포 배양은 DNA 손상^16,17에 대 한 침 샘 반응에 중요 한 p53 활성의 변조를 필요로 한다.

3 차원 살 리 구의 배양은 배양 초기 시점에서 줄기 및 전구 세포에 대해 풍부 하 고, 침 샘 세포의이 서브셋 인^9,18의 방사선 민감성을 이해 하는데 유용 하였다. 이러한 모든 배양 모델의 중요 한 제한은 세포 외 기질 (ECM) 및 다양 한 층을 통한 세포 세포 상호 작용을 포함 하는 침 샘의 3 차원 구조를 시각화 하는 데 효과가 없으며,이는 타 액 조절에 결정적인 역할을 합니다. 분 비¹⁵. 전체적으로 조직의 거동을 포괄 하는 방법에 대 한 필요성이 있지만, 또한 방사선 유발 침 샘의 근본적인 메커니즘을 더 발견 하기 위해 치료의 효과를 연구 하기 위해 실험실 조건 하에서 조작 될 수 있다 장애.

살아있는 조직 절편 및 문화는 이전에 문서화 되었습니다^19,20 종종 뇌 조직 상호 작용을 연구 하는 데 사용²¹. 이전 연구에서, 파 타 액 선 조직은 마우스 로부터 약 50 µm에서 단면화 되었고 최대 48 h까지 배양 하였으며, 생존 율, 세포 사 멸 및 기능을 분석 한 후¹⁹를 수행 하였다. Su 외. (2016) 35 µm 또는 50 µm에서 단면화 된 인간 턱 밑 샘 (SMGs)을 14 일 동안 배양 하 여이방법론을 확장 하였다. 제안 된 방법은 30 일 동안 50 µm 및 90 µm 및 배양에 대 한 평가에서 단면화 된 파와 턱 밑 침 샘 모두를 포함 한다는 것에서 전진 합니다. 조직 두께 범위를 절단 하는 능력은 분 비에 대 한 apical-basolateral 극성 및 신경 분포를 포함 하는 세포 프로세스와 관련 된 세포 세포 및 세포-ECM 상호작용을 평가 하는 데 중요 합니다. 더욱이, 침 샘 슬라이스는 배양 중에 조사 되어 방사선 유발 된 타 액 선 손상을 연구 하기 위한이 배양 모델의 타당성을 확인 하였다.

이 침 샘 유기 typic 배양 프로토콜의 목적은 배양 생존 율의 최대 시간을 평가 하 고 전 생체 방사선 치료 후 세포 변화를 특성화 하는 것입니다. 세포 사 멸을 위한, 트리 판 청색 염색, 살아있는 세포 염색 및 면역 조직 염색을 실행 가능한 최대 시간 섹션을 결정 하기 위해 수행 하였다. 공초점 현미경 및 면역 형광 염색은 특정 세포 집단, 형태학 적 구조 및 증식 수준을 평가 하기 위해 활용 되었다. 조직 섹션 배양은 또한이 3-d 모델에서 다양 한 마커에 대 한 방사선의 영향을 확인 하기 위해 이온화 방사선에 노출 되었다. 세포 사 멸 유도, 세포 골격 파괴, 분화 마커의 상실 및 조사 된 전 생체 배양에서의 보상 증식은 생체 내 모델의 이전 연구와 비교 하였다. 이 방법론은 방사선 손상에 따르는 세포 세포 상호 작용의 역할을 조사 하 고 치료 적 개입의 효능을 효율적으로 평가할 수 있는 실험적 모델을 제공 하는 수단을 제공 한다 (유전자 조작 또는 약리학 적 제제 )는 생체 내 모델에 대해 덜 적합할 수 있다.

Protocol

1. 진동의 제조 완충 트레이, 블레이드 부착, 아가 로스 블록 몰드 및 실험실 필름을 포함 하 여 진동의 분리 가능한 구성품을 70% 에탄올로 분무 한 다음 적어도 30 분 동안 자외선 살 균 합니다. 얼음이 떨어지는 것을 막기 위해 추가의 실험실 필름을 완충 트레이에 놓고 고정 하십시오. 얼음 실에 분쇄 된 얼음을 채우고 버퍼 트레이에서 실험실 필름을 제거 하 고 1% 페니실린-s…

Representative Results

1 차 2 차원 배양은 소 혈 청 (FBS) 보충 된 배지에서 성장 되 고, 일차 3 차원 살 리 구 배양은 전형적으로 무 혈 청 조건10,11에서 배양 된다. 추가적으로, 침 샘에서의 진동 배양을 활용 한 두 개의 이전 연구는 보충 된 배지 FBS을0% 또는 10%로 배양 하였다. 마우스 턱 밑의 슬라이스는 50 µm?…

Discussion

타 액 선 연구는 불멸 화 된 2-d 배양 물, 일차 2-d 배양 물, 3 차원 살 균 구 배양 물, 기저 생물학 및 생리학에 대 한 질문을 확인 하기 위해 배아에서의 3 차원 장기 배양을 포함 한 다양 한 문화권 모델을 활용 하 고 있습니다. 이러한 문화 모델 연구 질문의 다양 한 배열에 걸쳐 통찰력 있는 정보를 굴복 하 고 침 연구에서 중요 한 도구를 계속 됩니다. 이러한 배양 모델의 한계는 불멸 화 동안의 p53 ?…

Materials

Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold