Traitement par rayonnement des cultures organotypiques de modèles de glandes salivaires sous-mandibulaires et parotides clés caractéristiques in vivo
Summary
L’utilisation de cultures organotypiques tridimensionnelles pour visualiser la morphologie et les marqueurs fonctionnels des glandes salivaires peut donner de nouvelles perspectives sur les mécanismes des lésions des tissus après rayonnement. Décrit ici est un protocole à la section, culture, irradier, tache, et l’image des sections de glande salivaire d’épaisseur 50 – 90 μM avant et après l’exposition aux rayonnements ionisants.
Abstract
L’hyposalivation et la xérostomie créent des complications orales chroniques qui diminuent la qualité de vie chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou qui sont traités par radiothérapie. Les approches expérimentales de la compréhension des mécanismes du dysfonctionnement et de la restauration des glandes salivaires se sont concentrées sur des modèles in vivo, qui sont handicapés par l’incapacité de dépistage systématique des candidats thérapeutiques et d’efficacité dans la transfection capacité à manipuler des gènes spécifiques. Le but de ce protocole de culture organotypique de la glande salivaire est d’évaluer le temps maximal de viabilité de la culture et de caractériser les changements cellulaires après un traitement par rayonnement ex vivo. Nous avons utilisé la coloration immunofluorescente et la microscopie confocale pour déterminer quand des populations de cellules et des marqueurs spécifiques sont présents au cours d’une période de culture de 30 jours. En outre, les marqueurs cellulaires précédemment rapportés dans les modèles de rayonnement in vivo sont évalués dans les cultures qui sont irradiées ex vivo. Pour aller de l’avant, cette méthode est une plate-forme attrayante pour l’évaluation ex vivo rapide des réponses tissulaires de la glande salivaire et humaine aux agents thérapeutiques qui améliorent la fonction salivaire.
Introduction
La fonction de glande salivaire appropriée est essentielle à la santé bucco-dentaire et est altérée après le traitement du cancer de la tête et du cou avec la radiothérapie1. En 2017, près de 50 000 nouveaux cas de cancer de la tête et du cou ont été signalés aux États-Unis2. En raison des effets nocifs tissulaires et souvent irréversibles de la radiothérapie sur les tissus normaux environnants tels que les glandes salivaires, les patients sont souvent laissés avec des effets secondaires sévères et une qualité de vie diminuée2,3, 4. les autres. Les complications courantes causées par les radiations se manifestent par des symptômes tels que la xérostomie (le sentiment subjectif de la bouche sèche), les caries dentaires, la capacité altérée de mâcher et d’avaler, les troubles de la parole et les microbiomes oraux infectés2, 3 les trois , 4. ces symptômes collectivement peuvent conduire à la malnutrition et à la survie altérée chez les personnes touchées5. Alors que le dysfonctionnement de la glande salivaire dans cette population a été bien documenté, les mécanismes sous-jacents de dommages aux cellules acineuses ont été contestés, et il y a peu d’intégration parmi les différents modèles animaux6,7.
Les méthodes actuelles d’étude de la fonction des glandes salivaires et des dommages induits par les radiations comprennent l’utilisation de modèles in vivo, de lignées cellulaires immortalisées, de cultures de cellules primaires bidimensionnelles (2d) et de cultures tridimensionnelles (3-D) de salisphères8, 9,10,11,12. Traditionnellement, les modèles de culture cellulaire des lignées cellulaires immortalisées et des cultures 2D impliquent des cellules monocouches cultivées sur des surfaces planes et sont précieuses pour une expérimentation rapide, facile et rentable. Cependant, les conditions de culture de cellules artificielles peuvent altérer l’état de différenciation et les réponses physiologiques des cellules exposées à diverses conditions, et les résultats ne parviennent souvent pas à se traduire en modèles d’organismes entiers14,15. En outre, les cultures cellulaires immortalisées nécessitent une modulation de l’activité de la culture, ce qui est essentiel pour la réponse de la glande salivaire aux dégâts de l’ADN16,17.
les cultures de salisphères 3-D sont enrichies pour les cellules souches et progénitrices aux premiers moments de la culture et ont été utiles pour comprendre la radiosensibilité de ce sous-ensemble de cellules de glandes salivaires9,18. Une limitation critique de tous ces modèles de culture est qu’ils sont inefficaces dans la visualisation de la structure 3D de la glande salivaire, y compris la matrice extracellulaire (ECM) et les interactions cellule-cellule sur diverses couches, qui sont cruciales dans la modulation salivaire la sécrétion15. La nécessité d’une méthode qui englobe le comportement du tissu dans son ensemble, mais peut également être manipulé dans des conditions de laboratoire pour étudier les effets du traitement est nécessaire pour découvrir plus loin les mécanismes sous-jacents de la glande salivaire induite par rayonnement dysfonction.
La culture et la sectionnement des tissus vivants ont été documentées antérieurement19,20 et sont souvent utilisées pour étudier les interactions cerveau-tissu21. Dans des études antérieures, le tissu de la glande salivaire parotide (PAR) des souris a été sectionné à environ 50 μM et cultivé jusqu’à 48 h, et l’analyse de la viabilité, de la mort cellulaire et de la fonction a été effectuée par la suite19. Su et coll. (2016) a élargi cette méthodologie en cultivant les glandes sous-mandibulaires humaines (SMGs) sectionnées à 35 μm ou 50 μM pendant 14 jours20. La méthode proposée est une avancée en ce qu’elle comprend à la fois les glandes salivaires parotidiques et sous-mandibulaires sectionnées à 50 μM et 90 μm et l’évaluation des cultures pendant 30 jours. La capacité de couper une gamme d’épaisseur tissulaire est importante dans l’évaluation des interactions cellule-cellule et cellules-ECM qui sont pertinentes pour les processus cellulaires, y compris la polarité apical-basolatérale et l’innervation pour la sécrétion. En outre, les tranches de glandes salivaires ont été irradiées alors qu’elles étaient en culture pour déterminer la faisabilité de ce modèle de culture pour étudier les dommages causés par la glande salivaire induite par le rayonnement.
Le but de ce protocole de culture organotypique de la glande salivaire est d’évaluer le temps maximal de viabilité de la culture et de caractériser les changements cellulaires après un traitement par rayonnement ex vivo. Pour déterminer les sections de temps maximales qui sont viables post-dissection, coloration bleu trypan, coloration des cellules vivantes, et la coloration immunohistochimique pour la mort cellulaire ont été effectuées. La microscopie confocale et la coloration immunofluorescente ont été utilisées pour évaluer les populations cellulaires spécifiques, les structures morphologiques et les niveaux de prolifération. Les cultures des sections tissulaires ont également été exposées à des rayonnements ionisants pour déterminer les effets du rayonnement sur divers marqueurs dans ce modèle 3D. L’induction de la mort cellulaire, la perturbation du cytosquelette, la perte de marqueurs de différenciation et la prolifération compensatoire dans les cultures ex vivo irradiées ont été comparées à des études antérieures de modèles in vivo. Cette méthodologie fournit un moyen d’étudier le rôle des interactions cellulaires-cellules suite aux dommages causés par les radiations et fournit un modèle expérimental pour évaluer efficacement l’efficacité des interventions thérapeutiques (manipulations géniques ou agents pharmacologiques ) qui peuvent être moins adaptés aux modèles in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La recherche sur les glandes salivaires a utilisé un certain nombre de modèles de culture, y compris des cultures 2-D immortalisées, des cultures 2-D primaires, des cultures de salisphères 3-d et des cultures d’organes 3-D issues d’explants embryonnaires pour déterminer les questions sur la biologie et la physiologie sous-jacentes. Ces modèles de culture ont donné des informations perspicaces dans un éventail varié de questions de recherche et continueront d’être des outils importants dans la recherche sa…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé en partie par le financement pilote fourni par l’Université de l’Arizona Bureau de la recherche et de la découverte et instituts nationaux de la santé (R01 DE023534) à Kirsten Limesand. La bourse de formation en biologie du cancer, T32CA009213, a fourni un soutien à l’allocation pour Wen Yu Wong. Les auteurs aimeraient remercier M. Rice pour sa précieuse contribution technique.
Materials
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
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