本协议是使用体外表面测定在标准荧光显微镜上实施干扰反射显微镜的指南,用于使用体外表面测定对微管进行无标签、高对比度、高速成像。
有几种方法可以可视化表面附近的纯化生物分子。全内部反射荧光 (TIRF) 显微镜是一种常用的方法,但有其缺点是需要荧光标记,这可能会干扰分子的活动。此外,光漂白和光损伤也是问题。对于微管,我们发现使用干扰反射显微镜(IRM)可以获得与TIRF质量相似的图像。这表明IRM可能是一种在体外可视化大型生物分子和寡聚物动力学的通用技术。本文介绍了荧光显微镜如何进行改进,以获得IRM图像。与其他对比技术(如差分干涉对比度显微镜或干涉散射显微镜)相比,IRM 更容易实现,而且成本更低。与暗场显微镜相比,它也不易受到表面缺陷和溶液杂质的影响。使用IRM,结合本文描述的图像分析软件,视野和帧速率仅受摄像机限制;使用 sCMOS 摄像机和宽场照明微管长度可精确测量至 20 nm,带宽为 10 Hz。
微管的无标签成像是值得关注的,因为它绕过了对图布林的荧光标记以在图像中产生对比度的需要。荧光贴标有几个缺点:如果蛋白质浓度低1,光漂白和光损伤限制了观察时间,则不可行。已经使用几种技术来成像无标签的微管,包括视频增强差分干扰对比度显微镜(DIC)和暗场显微镜2,3,4,5。最近,干涉散射显微镜(iSCAT)6、旋转相干散射显微镜(ROCS)7和空间光干涉显微镜(SLIM)8也被使用。 所有这些技术都能够成像微管,并已证明对研究微管动力学有价值的。但是,每个都有各自的限制。在 DIC 中,对比度取决于微管和诺马斯基棱镜轴之间的角度。 在暗场中,微管信号因杂质或表面缺陷的散射光而退化。尽管 iSCAT 具有非凡的灵敏度(下至单个蛋白质),ROCS 可以深入样品中成像微管,但两种方法在技术上都要求很高,需要激光扫描仪。
该协议演示了如何设置干扰反射显微镜(IRM)9,10作为无标签成像微管的替代技术。IRM 易于实施,因为它只需要在标准荧光显微镜中添加一个廉价的 50/50 镜子。当与此处描述的软件结合使用时,IRM 可生成高对比度微管图像,能够高速拍摄大视场,需要一次性对齐,并可轻松与其他技术(如荧光成像)结合使用。
该协议演示了 IRM 在微管动力学成像和测量中的成功应用。应注意正确设置照明数值光圈,因为它对图像对比度的影响最大。此外,使用高数值光圈 (NA) 目标对于获得高分辨率/高对比度图像非常重要,因为与低 NA 目标相比,较高的 NA 目标具有更高的光收集能力。表面和溶液的清洁程度越低,因为污垢最终附着在表面,并在实验过程中向图像添加类似噪声的斑点。背景图像的采集非常重要,因为它可以消除均匀性、静态噪声和表面不规则性的照明。
建议的修改是在照明路径中引入长通滤波器(>600 nm)。白色光源的光谱通常含有紫外线中的波长,这些波长会损害微管。此外,在将 IRM 与荧光相结合(例如,在研究微管相关蛋白 (MAPs) 对微管动力学的影响时,使用长波长度对于 IRM 会很有用。请注意,当对花费的时间段进行成像时,由于图像平面偏离背景平面,样品漂移(尤其是沿光轴)会降低图像对比度。现代显微镜通常配备稳定机制(例如,完美聚焦(尼康),明确对焦2(蔡司),IX3-ZDC2(奥林巴斯)。另一种解决方案是被动或主动地稳定设置,或者纠正漂移19,20,21。最后,微管对比度可以通过减小场膜片的大小来增加(70%的开口是很好的选择,因为它是增加对比度和视场尺寸之间的平衡)15。
虽然 IRM 适合成像微管,但它不够灵敏,无法检测单个蛋白质。对于此类应用,iSCAT 是一种更合适的技术。同样,如果需要小于 10 nm 的跟踪精度,荧光和 iSCAT 更适合。对于 IRM,测量的长度跟踪精度为 ±20 nm,如图7所示。
在表面测定中使用IRM可以超越微管;例如,分子马达可以贴上金纳米粒子的标签,并在它们与微管相互作用时进行跟踪。此外,一种更先进的IRM形式称为反射干涉对比度显微镜(RICM)22,原则上可用于进一步增强微管对比度,并获得更高的跟踪精度。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢安娜·卢奇尼亚克和郭银伟对协议的批评性阅读和评论。
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |