इस प्रोटोकॉल लेबल मुक्त, उच्च विपरीत, microtubules के उच्च गति इमेजिंग इन विट्रो सतहों पर परख का उपयोग करने के लिए एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपको लागू करने के लिए एक गाइड है.
सतहों के निकट शुद्ध जैव अणुओं को विज़ुअलाइज़ करने के लिए कई तरीके हैं। कुल-आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट (TIRF) माइक्रोस्कोपी एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया विधि है, लेकिन दोष है कि यह फ्लोरोसेंट लेबलिंग की आवश्यकता है, जो अणुओं की गतिविधि के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. इसके अलावा, photobleaching और photodamage चिंता कर रहे हैं. माइक्रोट्युबल्स के मामले में, हमने पाया है कि टीआईआरएफ के समान गुणवत्ता की छवियों को हस्तक्षेप परावर्तन माइक्रोस्कोपी (आईआरएम) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह पता चलता है कि IRM इन विट्रो में बड़े जैव अणुओं और oligomers की गतिशीलता visualizing के लिए एक सामान्य तकनीक हो सकती है. इस पत्र में, हम बताते हैं कि कैसे एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप बस IRM छवियों को प्राप्त करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. IRM आसान है और काफी सस्ता है इस तरह के अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोकॉपी या interferometric प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी के रूप में अन्य विपरीत तकनीकों की तुलना में लागू करने के लिए. यह डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी की तुलना में सतह दोष और समाधान दोष के लिए भी कम संवेदनशील है। IRM का उपयोग करना, इस पेपर में वर्णित छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ, दृश्य का क्षेत्र और फ़्रेम दर केवल कैमरे द्वारा सीमित है; एक sCMOS कैमरा और व्यापक क्षेत्र रोशनी microtubule लंबाई के साथ अप करने के लिए परिशुद्धता के साथ मापा जा सकता है 20 एनएम की एक बैंडविड्थ के साथ 10 हर्ट्ज.
माइक्रोट्युबकेस के लेबल-मुक्त इमेजिंग ब्याज की है क्योंकि यह छवियों में इसके विपरीत उत्पन्न करने के लिए ट्यूबुलिन के फ्लोरोसेंट लेबलिंग की आवश्यकता को दरकिनार करता है। फ्लोरोसेंट लेबलिंग में कई कमियां हैं: यह संभव नहीं है अगर प्रोटीन एकाग्रता कमहै 1 और photobleaching और photodamage अवलोकन समय सीमा। कई तकनीकों का इस्तेमाल लेबल-मुक्त माइक्रोट्यूब्यूल्स की छवि बनाने के लिए किया गया है, जिसमें वीडियो-एन्हांस्ड डिफरेंट इंटरप्रेसी डवरमाइक्रोस्कोपी (डीआईसी) और डार्कफील्ड माइक्रोस्कोपी 2,3,4,5शामिल हैं। हाल ही में, इंटरफेरोमेट्रिक प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी (iSCAT)6,घूर्णन-समन्वय माइक्रोस्कोपी (ROCS)7 और स्थानिक प्रकाश हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी (एसईपी)8का भी उपयोग किया गया है। इन सभी तकनीकों microtubules इमेजिंग करने में सक्षम हैं और microtubule गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान साबित कर दिया है. हालांकि, प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं। DIC में इसके विपरीत microtubule और Nomarski प्रिज्म अक्ष के बीच कोण पर निर्भर करता है. डार्कफील्ड में, माइक्रोट्युबल संकेत अशुद्धियों या सतहों दोषों से बिखरे हुए प्रकाश द्वारा निम्नीकृत होता है। हालांकि iSCAT असाधारण संवेदनशीलता दर्शाती है (एक प्रोटीन के नीचे) और ROCS नमूना में गहरी microtubules छवि कर सकते हैं, दोनों तरीकों तकनीकी रूप से मांग कर रहे हैं, लेजर स्कैनर की आवश्यकता होती है.
इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (IRM)9,10 microtubules के लेबल मुक्त इमेजिंग के लिए एक वैकल्पिक तकनीक के रूप में स्थापित किया जा सकता है. IRM को लागू करने के रूप में यह केवल एक मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के लिए एक सस्ती 50/ जब यहाँ वर्णित सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, IRM उच्च विपरीत microtubule छवियों का उत्पादन, उच्च गति पर देखने के बड़े क्षेत्रों छवि कर सकते हैं, एक onetime संरेखण की आवश्यकता है, और आसानी से इस तरह के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के रूप में अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है.
इस प्रोटोकॉल इमेजिंग और microtubule गतिशीलता की माप के लिए IRM के सफल उपयोग का प्रदर्शन किया. ध्यान सही ढंग से रोशनी संख्यात्मक एपर्चर सेट के रूप में यह छवि विपरीत पर सबसे मजबूत प्रभाव पड़ता है दिया जाना चाहिए. इसके अलावा, उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्यों का उपयोग कर उच्च संकल्प / उच्च विपरीत छवियों को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में उच्च एनए उद्देश्य कम एनए उद्देश्यों की तुलना में उच्च प्रकाश संग्रह शक्ति है. क्लीनर सतह और समाधान कम शोर का इस्तेमाल किया के रूप में गंदगी समाप्त होता है सतह के लिए संलग्न और जोड़ने (प्रयोग के दौरान) छवियों के लिए शोर की तरह धब्बे. एक पृष्ठभूमि छवि का अधिग्रहण महत्वपूर्ण है और साथ ही यह रोशनी inhomogeneities, स्थिर शोर और सतह अनियमितताओं को हटा.
एक सिफारिश संशोधन रोशनी पथ में एक लंबे पास फिल्टर (gt; 600 एनएम) शुरू करने के लिए है। सफेद प्रकाश स्रोतों के स्पेक्ट्रम आम तौर पर यूवी जो microtubules नुकसान कर सकते हैं में तरंगदैर्ध्य शामिल हैं. इसके अलावा, IRM के लिए लंबी लहर लंबाई का उपयोग कर काम में आता है जब फ्लोरोसेंट के साथ IRM संयोजन (उदाहरण के लिए, जब microtubule गतिशीलता पर microtubule जुड़े प्रोटीन (MAPs) के प्रभाव का अध्ययन). ध्यान रखें कि जब समय की व्यय अवधि के लिए इमेजिंग, नमूना बहाव (विशेष रूप से ऑप्टिकल अक्ष के साथ) पृष्ठभूमि विमान से छवि विमान के विचलन के कारण छवि इसके विपरीत कम हो जाती है. आधुनिक माइक्रोस्कोप अक्सर स्थिरीकरण तंत्र (उदाहरण के लिए, सही ध्यान (Nikon), निश्चित फोकस.2 (ज़िस), IX3-जेडडीसी 2 (ओलम्पस) के साथ सुसज्जित हैं। एक वैकल्पिक समाधान है कि सेटअप को निष्क्रिय रूप से या सक्रिय रूप से18 को स्थिर किया जाए या बहाव19,20,21के लिए सही किया जाए . अंत में, microtubule इसके विपरीत क्षेत्र डायाफ्राम के आकार को कम करने से बढ़ाया जा सकता है (एक 70% खोलने अच्छा विकल्प है के रूप में यह बढ़ती इसके विपरीत और देखने के आकार के क्षेत्र के बीच एक संतुलन है)15.
जबकि IRM इमेजिंग microtubules के लिए उपयुक्त है यह पर्याप्त संवेदनशील नहीं है एकल प्रोटीन का पता लगाने के लिए. इस तरह के आवेदन के लिए, iSCAT एक अधिक उपयुक्त तकनीक है. इसी तरह, फ्लोरोसेंट और iSCAT बेहतर अनुकूल हैं अगर कम से कम 10 एनएम की सटीक ट्रैकिंग की जरूरत है. IRM के लिए, मापित लंबाई ट्रैकिंग परिशुद्धता $20 दउ है जैसा कि चित्र 7में दर्शाया गया है।
सतह पराख में IRM का उपयोग microtubules से परे जा सकते हैं; उदाहरण के लिए, आणविक मोटर्स सोने नैनोकणों के साथ लेबल और ट्रैक के रूप में वे microtubules के साथ बातचीत कर सकते हैं. इसके अलावा चिंतनशील हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (आरआईसीएम)22 के रूप में जाना जाता IRM का एक और अधिक उन्नत रूप, सिद्धांत रूप में, आगे microtubules इसके विपरीत बढ़ाने के लिए और उच्च ट्रैकिंग परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक अन्ना Luchniak और यिन-वी कुओ महत्वपूर्ण पढ़ने और प्रोटोकॉल पर टिप्पणी के लिए धन्यवाद.
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |