Questo protocollo è una guida per l’implementazione della microscopia a riflessione di interferenza su un microscopio a fluorescenza standard per l’imaging senza etichette, ad alto contrasto e ad alta velocità dei microtubuli utilizzando analisi in vitro.
Esistono diversi metodi per visualizzare le biomolecole purificate vicino alle superfici. La microscopia a fluorescenza totale-interna (TIRF) è un metodo comunemente usato, ma ha lo svantaggio che richiede un’etichettatura fluorescente, che può interferire con l’attività delle molecole. Inoltre, il fotosbiancamento e i danni fotografici sono preoccupazioni. Nel caso dei microtubuli, abbiamo scoperto che immagini di qualità simile a TIRF possono essere ottenute utilizzando la microscopia di riflessione delle interferenze (IRM). Ciò suggerisce che IRM potrebbe essere una tecnica generale per visualizzare la dinamica di grandi biomolecole e oligomeri in vitro. In questo articolo, mostriamo come un microscopio a fluorescenza può essere modificato semplicemente per ottenere immagini IRM. L’IRM è più facile e notevolmente più economico da implementare rispetto ad altre tecniche di contrasto come la microcopia a contrasto delle interferenze differenziali o la microscopia a dispersione interferometrica. È anche meno suscettibile ai difetti superficiali e alle impurità della soluzione rispetto alla microscopia darkfield. Utilizzando IRM, insieme al software di analisi delle immagini descritto in questo documento, il campo visivo e la frequenza fotogrammi sono limitati solo dalla fotocamera; con una telecamera sCMOS e una lunghezza dei microtubuli di illuminazione a campo largo possono essere misurate con precisione fino a 20 nm con una larghezza di banda di 10 Hz.
L’imaging senza etichette di microtubuli è di interesse in quanto elude la necessità di etichettatura fluorescente della tubulina per generare contrasto nelle immagini. L’etichettatura fluorescente presenta diversi inconvenienti: non è possibile se la concentrazione proteica è bassa1 e il fotosbleaching e il fotodanno limitano il tempo di osservazione. Diverse tecniche sono state utilizzate per l’immagine di microtubuli senza etichetta, tra cui la microscopia a contrasto delle interferenze differenziali potenziata video (DIC) e la microscopia darkfield2,3,4,5. Recentemente, sono state utilizzate anche la microscopia a dispersione interferometrica (iSCAT)6, la microscopia a dispersione rotante-coerente (ROCS)7 e la microscopia a interferenza spaziale della luce (SLIM)8. Tutte queste tecniche sono in grado di imaging microtubuli e si sono dimostrate preziose per lo studio della dinamica dei microtubuli. Tuttavia, ognuno ha i propri limiti. In DIC il contrasto dipende dall’angolo tra il microtubulo e l’asse del prisma Nomarski. Nel campo oscuro, il segnale del microtubulo è degradato dalla luce diffusa proveniente da impurità o difetti superficiali. Anche se iSCAT presenta una straordinaria sensibilità (fino a singole proteine) e ROCS può immagini microtubuli più in profondità nel campione, entrambi i metodi sono tecnicamente esigenti, che richiedono scanner laser.
Questo protocollo dimostra come la microscopia a riflessione di interferenza (IRM)9,10 può essere impostata come una tecnica alternativa per l’imaging senza etichette di microtubuli. IRM è facile da implementare in quanto richiede solo l’aggiunta di uno specchio 50/50 poco costoso a un microscopio fluorescente standard. Se utilizzato in combinazione con il software descritto qui, IRM produce immagini di microtubuli ad alto contrasto, può immaginare grandi campi visivi ad alta velocità, richiede un allineamento una tantore e può essere facilmente combinato con altre tecniche come l’imaging a fluorescenza.
Questo protocollo ha dimostrato il successo dell’uso di IRM per l’imaging e la misurazione della dinamica dei microtubuli. Occorre prestare attenzione a impostare correttamente l’apertura numerica dell’illuminazione in quanto ha il maggiore impatto sul contrasto dell’immagine. Inoltre, l’utilizzo di obiettivi ad alta apertura numerica (NA) è importante per ottenere immagini ad alta risoluzione/contrasto elevato, poiché un obiettivo NA più alto ha una maggiore potenza di raccolta della luce rispetto agli obiettivi NA bassi. Più pulita è la superficie e le soluzioni utilizzate minore è il rumore quando lo sporco finisce per attaccarsi alla superficie e aggiungere (nel corso dell’esperimento) macchiare come il rumore alle immagini. L’acquisizione di un’immagine di sfondo è importante in quanto rimuove le inomogeneità dell’illuminazione, il rumore statico e le irregolarità superficiali.
Una modifica consigliata consiste nell’introdurre un filtro passa lungo (>600 nm) nel percorso di illuminazione. Lo spettro delle sorgenti di luce bianca contiene in genere lunghezze d’onda nei raggi UV che possono danneggiare i microtubuli. Inoltre, l’utilizzo della lunghezza a onde lunghe per IRM è utile quando si combina IRM con la fluorescenza (ad esempio, quando si studia l’effetto delle proteine associate ai microtubuli (MAC) sulla dinamica dei microtubuli. Tenere presente che quando si esegue l’imaging per un periodo di tempo accelerato, la deriva del campione (soprattutto lungo l’asse ottico) riduce il contrasto dell’immagine a causa della deviazione del piano dell’immagine dal piano di sfondo. I microscopi moderni sono spesso dotati di meccanismi di stabilizzazione (ad es. messa a fuoco perfetta (Nikon), Messa a fuoco definita.2 (Eiss), IX3-‘DC2 (Olympus)). Una soluzione alternativa è quella di stabilizzare termicamente l’impostazione passivamente o attivamente18 o correggendo per deriva19,20,21. Infine, il contrasto dei microtubuli può essere aumentato riducendo le dimensioni del diaframma di campo (un’apertura del 70% è una buona scelta in quanto è un equilibrio tra contrasto crescente e campo di dimensione della vista)15.
Mentre IRM è adatto per l’imaging di microtubuli non è abbastanza sensibile per rilevare singole proteine. Per tale applicazione, iSCAT è una tecnica più adatta. Analogamente, la fluorescenza e iSCAT sono più adatte se è necessaria una precisione di tracciamento inferiore a 10 nm. Per IRM, la precisione di rilevamento della lunghezza misurata è di 20 nm, come illustrato nella Figura 7.
L’uso di IRM nei saggi di superficie può andare oltre i microtubuli; ad esempio, i motori molecolari possono essere etichettati con nanoparticelle d’oro e tracciati mentre interagiscono con i microtubuli. Inoltre, una forma più avanzata di IRM, nota come microscopia riflettente a contrasto di interferenza (RICM)22, può, in linea di principio, essere utilizzata per migliorare ulteriormente il contrasto dei microtubuli e ottenere una maggiore precisione di tracciamento.
The authors have nothing to disclose.
Gli Autori ringraziano Anna Luchniak e Yin-wei Kuo per la lettura critica e i commenti sul protocollo.
Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope used for perfoming the expriments |
50/50 beam splitter | Chroma | 21000 | When buying make sure to choose the splitter dimensions that fit the cube used in the microscope |
NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris objective | Nikon | MRH02902 | Imaging objective. This objective has a NA adjusting iris that was opened to NA 1.3 |
Mucasol universal detergent | Sigma-aAldrich | Z637181-2L | Used for cleaning coverslips and slides |
plastic paraffin film (commerical name Parafilm M) | Sigma-aAldrich | P7793 | Used for constructing flow channels |
Anti-TAMRA antibody | Invitrogen | A-6397 | Used to bind TAMRA labeled molecules (e.g. microtubules) to the sample surface. RRID (AB_2536196) |
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aAldrich | Used for blocking the channel surface to prevent nonspecific binding | |
40 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753637 | Used as a control sample |
20 nm gold nanoparticles | Sigma-aAldrich | 753610 | Used as a control sample |
Zyla 4.2 Camera | Andor | Zyla 4.2 | 2048×2048 pixles (6.5µm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16bit dynamic range |
Feista tracking software | https://www.bcube-dresden.de/fiesta/wiki/FIESTA | ||
Stabilized microtubles | prepared in house (see references in text) |