Visualizando proteína quinase uma atividade na cabeça-corrigido ratos comportando-se usando in vivo microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão
Summary
Um procedimento é apresentado para visualizar as atividades da proteína quinase A em ratos cabeça-fixados, comportando-se. Um repórter melhorado da atividade da um-quinase, tAKARα, é expressado em neurônios corticais e tornado acessível para A imagem latente através de uma janela craniana. A microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão é usada para visualizar atividades de PKA in vivo durante a locomoção forçada.
Abstract
Neuromodulação exerce controle poderoso sobre a função cerebral. A disfunção de sistemas neuromodulatórios resulta em distúrbios neurológicos e psiquiátricos. Apesar de sua importância, as tecnologias para rastrear eventos neuromodulatórios com resolução celular estão apenas começando a surgir. Neuromoduladores, como dopamina, norepinefrina, acetilcolina e serotonina, desencadeiam eventos de sinalização intracelular através de seus respectivos receptores acoplados à proteína G para modular a excitabilidade neuronal, comunicações sinápticas e outros neurônios funções, regulando assim o processamento de informações na rede neuronal. Os Neuromoduladores acima mencionados convergem para a via de campo/proteína quinase A (PKA). Conseqüentemente, a imagem latente in vivo de pKa com definição da único-pilha foi desenvolvida como um leitura para eventos neuromoduladoras em uma maneira análoga à imagem latente do cálcio para atividades elétricas neuronal. Nisto, um método é apresentado para visualizar a atividade de PKA no nível de neurônios individuais no córtice de ratos de comportamento cabeça-fixados. Para fazer assim, um repórter melhorado da atividade da um-quinase (AKAR), chamado tAKARα, é usado, que é baseado na transferência da energia da ressonância de Förster (FRET). Este sensor de PKA genetically-codificado é introduzido no córtice de motor através do Electroporation do utero (IUE) de Plasmids do ADN, ou da injeção Stereotaxic do vírus adeno-associado (AAV). As mudanças do FRET são imaged usando a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão (2pFLIM), que oferece vantagens sobre medidas ratiométricas do FRET para quantificar o sinal do FRET no tecido de luz-espalhamento do cérebro. Para estudar as atividades de PKA durante a locomoção forçada, tAKARα é imaged através de uma janela craniana crônica acima do córtice de ratos acordados, cabeça-fixos, que correm ou descansam em uma esteira motorizada velocidade-controlada. Esta aproximação da imagem latente será aplicável a muitas outras regiões do cérebro para estudar atividades de PKA comportamento-induzidas correspondentes e a outros sensores FLIM-baseados para a imagem latente in vivo.
Introduction
A neuromodulação, também conhecida como transmissão sináptica lenta, impõe um forte controle sobre a função cerebral durante diferentes Estados comportamentais, como estresse, excitação, atenção e locomoção1,2,3 4. apesar de sua importância, o estudo de quando e onde os eventos neuromodulatórios acontecem ainda está em sua infância. Neuromoduladores, incluindo acetilcolina, dopamina, noradrenalina, serotonina, e muitos neuropeptídeos, ativam receptores acoplados à proteína G (GPCRs), que por sua vez desencadeiam vias de mensageiro intracelular segundo com uma ampla janela de escalas de tempo variando de segundos a horas. Enquanto cada neuromodulador desencadeia um conjunto distinto de eventos de sinalização, a via de campo/proteína quinase a (PKA) é uma via de downstream comum para muitos Neuromoduladores1,5. O caminho do acampamento/pKa regula a excitabilidade neuronal, a transmissão sináptica e a plasticidade6,7,8,9e, portanto, ajusta a dinâmica da rede neuronal. Como diferentes neurônios ou tipos neuronais expressam diferentes tipos ou níveis de receptores do neuromodulador10, os efeitos intracelulares do mesmo neuromodulador extracelular podem ser heterogêneos em diferentes neurônios e, portanto, devem ser estudado com resolução celular. Até o momento, continua a ser desafiador monitorar eventos neuromodulatórios em neurônios individuais in vivo durante o comportamento.
Para estudar a dinâmica espaciotemporal da neuromodulação, é necessária uma modalidade de gravação adequada. A microdiálise e a voltametria cíclica de varredura rápida são freqüentemente usadas para estudar a liberação de Neuromoduladores, mas não têm a resolução espacial para monitorar eventos celulares11,12. Análoga à dinâmica do cálcio que está sendo usada como um proxy para a atividade elétrica neuronal na imagem latente da população13, a imagem latente de pKa pode ser usada para ler para fora eventos neuromoduladoras através de uma população neuronal na definição celular. O protocolo atual descreve o uso de um repórter melhorado da atividade da um-quinase (AKAR) para monitorar atividades do PKA in vivo durante o comportamento animal. O método descrito aqui permite a imagem latente simultânea de populações neuronal na definição subcellular com uma definição temporal que rastreia eventos neuromodulatórios fisiológicos.
Os akars são compostos por um doador e um aceitador de proteínas fluorescentes ligadas por um peptídeo de substrato de fosforilação de pKa e um domínio associado à forkhead (FHA) que se liga à serina fosforilada ou treonina do substrato14,15. Após a ativação da via PKA, o peptídeo de substrato de AKAR é fosforilado. Como resultado, o domínio FHA liga-se ao peptídeo fosforilado de substrato, trazendo assim os dois fluoróforos em estreita proximidade, referido como o estado fechado de AKAR. O estado fechado de um AKAR fosforilada conduz à transferência aumentada da energia da ressonância de Förster (fret) entre os Fluorophores do doador e do acceptor. Uma vez que a proporção de akars fosforilados está relacionada com o nível de atividade do pKa16, a quantidade de traste numa amostra biológica pode ser utilizada para quantificar o nível de atividade do pKa16,17,18, 19,20.
As versões adiantadas de AKARs foram projetadas primeiramente para a imagem latente ratiométrica de duas cores14. Quando a imagem latente mais profunda no tecido de cérebro, o método raciométrica sofre da distorção do sinal devido à dispersão de luz comprimento de onda-dependente17,18,21. Como discutido abaixo, a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência (flim) elimina este problema porque flim mede somente os fótons emitidos pelo fluoróforo fornecedor18,21. Como resultado, a quantificação de FLIM de FRET não é afetada pela profundidade do tecido17. Além disso, uma variante “escura” (i.e., baixa produção quântica [QY]) do fluoróforo aceptor pode ser usada. Isso libera um canal de cor para facilitar a medição multiplexada de propriedades neuronais ortogonais via imagem simultânea de um segundo sensor ou um marcador morfológico17,19,20.
A imagem latente de flim quantifica o tempo que um fluoróforo gasta no estado excited, isto é, a vida da fluorescência18. O retorno de um fluoróforo ao estado de terra, assim o fim do estado excitado, frequentemente concomitates com a emissão de um Photon. Embora a emissão de um fóton para uma molécula animada individual é estocástica, em uma população a vida média de fluorescência é uma característica desse fluoróforo particular. Quando uma população pura de fluoróforos são excitados simultaneamente, a fluorescência resultante seguirá uma única deterioração exponencial. A constante de tempo desta deterioração exponencial corresponde à vida média da fluorescência, que varia tipicamente de um a quatro nanossegundos para proteínas fluorescentes. O retorno de um fluoróforo doador excited ao estado à terra pode igualmente ocorrer por fret. Na presença de FRET, a vida de fluorescência do fluoróforo do doador é reduzida. Os akars resíduo exibem uma vida fornecedora relativamente mais longa da fluorescência. Após a fosforilação por PKA, o sensor exibe uma vida mais curta porque os fluoróforos doador e aceitador são trazidos perto uns dos outros e FRET é aumentada. A quantificação da vida da fluorescência em uma população de AKARs representa conseqüentemente o nível de atividade de PKA.
As primeiras versões de AKARs não foram usadas com sucesso para a imagem latente in vivo na definição da único-pilha. Isto é principalmente devido à baixa amplitude do sinal dos sensores de AKAR às ativações fisiológicas17. Recentemente, comparando sistematicamente os sensores disponíveis de AKAR para a microscopia da imagem latente da vida da fluorescência do dois-fotão (2pflim), um sensor chamado flim-AKAR foi encontrado para superar sensores alternativos. Além disso, uma série de variantes de FLIM-AKAR chamadas de AKARs direcionados (tAKARs) foram desenvolvidas para visualizar a atividade de PKA em locais subcelulares específicos: microtúbulos (tAKARα), citosol (tAKARβ), actina (tAKARδ), actina filamentosa (tAKARε), membrana (tAKARγ), e densidade pós-sináptica (tAKARζ). Entre tAKARs, tAKARα aumentou a amplitude do sinal eliciada pela norepinefrina por 2,7 vezes. Isso é consistente com o conhecimento de que a maioria dos pKa nos neurônios está ancorada a microtúbulos no estado de repouso22,23. tAKARα foi o melhor intérprete entre os AKARs existentes para 2pFLIM. Além disso, tAKARα detectou atividade fisiologicamente relevante de PKA eliciada por múltiplos Neuromoduladores, e a expressão de tAKARα não alterou as funções neuronais17.
Recentemente, o tAKARα foi usado com sucesso para visualizar as atividades da PKA em camundongos com comportamento fixo de cabeça17. Mostrou-se que a locomoção forçada desencadeou a atividade de PKA no soma de neurônios superficiais da camada (camada 1 a 3, até uma profundidade de ~ 300 μm da pia) no motor, no tambor, e nos córtices visuais. A atividade de PKA locomoção-desencadeada era na parte dependente da sinalização através dos receptores β-adrenergic e dos receptores do dopamine D1, mas não foi afetada por um antagonista do receptor do dopamine D2. Este trabalho ilustra a capacidade de tAKARs para rastrear eventos de neuromodulação in vivo usando 2pFLIM.
No protocolo atual, o método inteiro para a imagem latente da atividade de PKA em ratos acordados cabeça-fixados durante um paradigma forçado da locomoção é descrito em seis etapas. Primeiro, a adição de capacidades 2pFLIM a um microscópio convencional de dois fótons (Figura 1). Em segundo lugar, a construção de uma esteira motorizada (Figura 2). Em terceiro lugar, a expressão do sensor de tAKARα no córtex do rato por in utero Electroporation (IUE) de plasmíos de DNA, ou injeção estereotaxica de vírus adeno-associado (AAV). Os protocolos excelentes para cirurgias para IUE24,25 e a injeção Stereotaxic de partículas virais26 foram publicados previamente. Os principais parâmetros que usamos são descritos abaixo. Adiante, a instalação de uma janela craniana. Os protocolos excelentes foram publicados previamente para a cirurgia da janela craniana27,28. Várias etapas que foram modificadas dos protocolos padrão são descritas. Quinto, realizando in vivo 2pFLIM. Sexto, as análises das imagens 2pFLIM (Figura 3 e Figura 4). Esta aproximação deve prontamente ser aplicável a muitos outros paradigmas comportamentais cabeça-fixos e áreas do cérebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo demonstra o uso do sensor tAKARα de FRET-FLIM para visualizar a atividade de PKA neuromodulação-disparada em ratos de comportamento cabeça-fixados. Esta aplicação é baseada em testes extensivos e caracterizações de tAKARα in vitro e in vivo para demonstrar que o sinal FLIM obtido é relevante para eventos neuromodulatórios fisiológicos17. Aqui, uma aplicação in vivo, atividade de PKA locomoção induzida no córtex motor, é usada para descrever os procedimentos para e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos A Sra. Tess J. Lameyer, A Sra. Ruth Frank, e o Dr. Michael A. Muniak por edições e comentários, e o Dr. Ryohei Yasuda no Max Planck Florida para o software de aquisição 2pFLIM. Este trabalho foi apoiado por dois prêmios BRAIN Initiative U01NS094247 (H.Z. e TM) e R01NS104944 (H.Z. e TM), um R01 Grant R01NS081071 (TM), e um R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Todos os prêmios são do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e Stroke, Estados Unidos.
Materials
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
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