Summary

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injektionen für optogenetische Stimulation von Long-Range-Eingängen in Maus Gehirn Scheiben

Published: September 20, 2019
doi:

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, um die zelltypspezifische funktionelle Konnektivität von Ferneingaben aus entfernten Hirnregionen mithilfe optogenetischer Stimulationen in ex vivo Gehirnscheiben zu identifizieren.

Abstract

Kenntnisse über zellspezifische synaptische Konnektivität sind eine entscheidende Voraussetzung für das Verständnis hirnbreiter neuronaler Schaltkreise. Die funktionelle Untersuchung von Fernverbindungen erfordert gezielte Aufnahmen einzelner Neuronen in Kombination mit der spezifischen Stimulation identifizierter entfernter Eingänge. Dies ist oft schwierig mit konventionellen und elektrischen Stimulationstechniken zu erreichen, da Axone aus konvergierenden vorgelagerten Hirnbereichen sich in der Zielregion vermischen können. Die stereotaxic-Targeting einer bestimmten Hirnregion für die virusvermittelte Expression lichtempfindlicher Ionenkanäle ermöglicht eine selektive Stimulation von Axonen aus dieser Region mit Licht. Intracerebrale stereotaxic Injektionen können in gut abgegrenzten Strukturen, wie die vorderen thalamic Kerne, zusätzlich zu anderen subkortikalen oder kortikalen Bereichen im gesamten Gehirn verwendet werden.

Beschrieben hier ist eine Reihe von Techniken für die präzise stereotaxic Injektion von viralen Vektoren, die Channelrhodopsin im Mausgehirn, gefolgt von Photostimulation von Axon-Terminals in der Gehirnscheibe Vorbereitung. Diese Protokolle sind einfach und weit verbreitet. In Kombination mit der Ganzzell-Patchklemmenaufzeichnung aus einem postsynaptisch verbundenen Neuron ermöglicht die Photostimulation von Axonen den Nachweis funktioneller synaptischer Verbindungen, die pharmakologische Charakterisierung und die Beurteilung ihrer Stärke. Darüber hinaus kann die Biozytinfüllung des aufgezeichneten Neurons zur post-hoc morphologischen Identifizierung des postsynaptischen Neurons verwendet werden.

Introduction

Die Definition der Konnektivität zwischen Hirnregionen ist notwendig, um neuronale Schaltkreise zu verstehen. Klassische anatomische Tracing-Methoden ermöglichen die Etablierung interregionaler Konnektivität, und Läsionsstudien helfen, die hierarchische Organisation des Informationsflusses zu verstehen. Zum Beispiel beinhalten Gehirnkreise für räumliche Orientierung und Kopfrichtungssignalisierung den Richtungsfluss von Informationen vom Thalamus zum Presubiculum. Dies wurde durch Läsionsstudien von antero-dorsalen thalamischen Kernen (ADN) nachgewiesen, die das Kopfrichtungssignal im nachgeschalteten dorsalen Presubiculum abbauen, sowie das parahippocampale Gitterzellsignal1,2.

Die funktionelle Konnektivität zwischen Hirnbereichen ist schwieriger auf zellulärer und subzellulärer Ebene zu etablieren. Im Hippocampus ermöglicht eine hochorganisierte Anatomie die Untersuchung von signalspezifischen synaptischen Verbindungen mittels elektrischer Simulation in der Scheibenpräparation. Stimulationselektroden, die in der Stratum radiatum von CA1 platziert werden, können gezielt verwendet werden, um den Schaffer-Kollateraleinsatz aus CA33gezielt zu stimulieren. Stimulierende Elektroden, die in Stratum lacunosum moleculare von CA1 platziert werden, aktivieren den perforanten Pfadeingang zu CA14,5. Elektrische Stimulation aktiviert Neurotransmitter Freisetzung von Axon-Terminals; es aktiviert jedoch Neuronen mit Somata in der Nähe der Stimulationsstelle sowie Axone der Passage. Es ist daher von begrenztem Nutzen für die Untersuchung von Afferents aus definierten Hirnregionen, wenn Fasern verschiedener Herkunftsregionen in der Zielstruktur verwechseln, wie es typischerweise im Neocortex der Fall ist.

Neuronen können auch mit Licht stimuliert werden. Optische Methoden umfassen die Photoaktivierung von Käfigglutamat, die mit ein- oder zweiphotonen Laserscanning kombiniert werden kann. Mehrere eng verteilte Stellen können sequenziell stimuliert werden, ohne mechanische Schäden am Gewebe6. Dies wurde erfolgreich verwendet, um synaptische Rezeptoren zu kartieren sowie einzelne Neuronen zu aktivieren7. Während Glutamat-Unkaging für die lokale Schaltungsanalyse verwendet werden kann, erlaubt es keine spezifische Aktivierung von Ferneingängen.

Eine Methode der Wahl für die Untersuchung der Langstreckenkonnektivität in neuronalen Schaltkreisen ist die Verwendung von virusvermittelter Kanalrhodopsin-Expression. Mit in vivo stereotaxic Injektionen, wie hier beschrieben, kann der Ausdruck von lichtgebundenen Ionenkanälen gezielt und räumlich auf eine gewünschte Hirnregion beschränkt werden. Auf diese Weise sind Kanalrhodopsine wirksam für die Kartierung erregender oder hemmender Konnektivität von einer Region zu ihrem Ziel. Transfizierte Axonklemmen können mit Licht in einer Gehirnscheibenpräparation stimuliert werden, und Patch-Clamp-Aufnahmen als Auslese ermöglichen die Untersuchung der Funktionen und Stärken bestimmter Schaltungskomponenten im Gehirn8. Der optogenetische Ansatz in Kombination mit der stereotaxic-Injektion eines Virus bietet eine beispiellose Spezifität und genetische Kontrolle9. Stimulieren mit Licht ermöglicht zusätzlich sowohl hohe zeitliche als auch räumliche Präzision10,11.

Das Presubiculum ist eine sechsschichtige kortikale Struktur am Übergang des Hippocampus und der Parahippocampusformation12,13. Es erhält wichtige synaptische Eingaben aus dem ADN11, aber auch aus mehreren anderen kortikalen und subkortikalen Regionen14. Somit ist die selektive Stimulation von thalamischen Axonklemmen innerhalb einer präsubikulären Scheibe weder mit elektrischer Stimulation noch mit Glutamat-Unkaging möglich. Beschrieben in diesem Protokoll sind Methoden zur Bestimmung der funktionellen Konnektivität zwischen Hirnregionen (ADN und Presubiculum) mithilfe präziser stereotaxic-Injektionen viraler Vektoren, die lichtgated Kanäle exdrücken. Ebenfalls beschrieben ist die Photostimulation von Axonen-Terminals von projizierten Neuronen in ihrer Zielregion, gekoppelt mit Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen von postsynaptischen Neuronen in der Hirnscheibenpräparation.

Protocol

Alle Verfahren wurden gemäß der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaft (2010/63/EU) durchgeführt und von der Ethikkommission der Universität Paris Descartes genehmigt. Der Experimentator muss die Genehmigung für das Verfahren einholen, um den örtlichen Vorschriften zu entsprechen. 1. Planung des Experiments Definieren Sie den Hirnbereich, der zielgerichtet werden soll. Bestimmen Sie die stereotaxic Koordinaten der Injektionsstelle mit Hilfe eines Maus-Gehirnatlas<s…

Representative Results

Das hier vorgestellte Verfahren wurde verwendet, um ein blaues lichtempfindliches Kanalrhodopsin (Chronos) auszudrücken, das mit GFP im antero-dorsalen Kern des Thalamus (ADN) durch stereotaxic-Injektion des anterogradeaden Adeno-assoziierten Virus verschmolzen wird. Die stereotaxic-Koordinaten wurden nach einem Maus-Gehirnatlas ermittelt und durch Injektion von 200 nL fluoreszierendem Tracer Fluor-Rubin getestet. Das Tier wurde 10 min nach der Injektion geopfert, und das Gehirn wurde über Nacht extrahiert und fixiert….

Discussion

In vivo virale Injektion, um lichtempfindliche Opsine in einem definierten Gehirnbereich auszudrücken, ist eine Wahlmethode für die optogenetische Analyse der langfristigen funktionellen Konnektivität10,11,17,18. Stereotaxie-Injektionen bieten die Möglichkeit, einen bestimmten Bereich des Gehirns genau anzusprechen. Die Koexpression eines Opsins mit einem fluoreszierenden Reporter ermöglic…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang und Jean Simonnet für ihre Hilfe bei der Entwicklung früherer Versionen des stereotaxic Injektionsprotokolls und Marin Manuel und Patrice Jegouzo für die technische Hilfe. Diese Arbeit wurde vom französischen Ministerium für Bildung und Forschung (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) und Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.) unterstützt.

Materials

0.5 mm bur  Harvard Apparatus 724962
10 µL Hamilton syringe Hamilton 1701 RN – 7653-01
10X PBS solution Thermofisher Scientific AM9624  text
36% PFA Sigma-Aldrich F8775
470 nm LED  Cairn Research P1105/470/LED  DC/59022m use with matched excitation filter 470/40x  and emission filter for GFP 
AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Penn Vector Core AV-5-PV3446 lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 
All chemicals Sigma
Bath temperature controler Luigs & Neumann SM7 Set at 34°C 
beveled metal needle Hamilton 7803-05 33 gauge, 13mm, point style 4-20°
Big scissors Dahle Allround 50038
Biocytin Sigma B4261 final 1-3 mg/ml
Borosilicate Capillaries Havard Apparatus GC150-10 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter
Brown Flaming electrode puller Sutter Instruments P-87
BupH Phosphate Buffered Saline pack Thermofisher Scientific 28372
butterfly needle for perfusion Braun  Venofix A 24G
CCD Camera Andor  DL-604M
Confocal Microscope Zeiss LSM710 20X
curved forceps FST  11011-17
CY5 configuration (confocal) Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 
CY5 configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72
DAPI Sigma D9542
DAPI configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60)
Digidata 1440A Axon Instruments
Digital handheld optical meter ThorLabs PM100D Parametered on 475 nm
Double egde stainless steel razor blades Electron Microscopy Sciences 72000 Use half of the blade in the slicer
Dual Fluorescent Protein Flashlight Nightsea DFP-1 excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass.
EGTA Sigma E4368 final 0,2 mM
Epifluorescence Microscope Nikon Eclipse TE-2000E 10 or 20X
Filter paper Whatman
Fluoro-Ruby 10% Millipore AG335 disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl
GFP configuration (epifluo) Nikon/Chroma Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555)
Heatingplate Physitemp HP4M
Heparin choay 5000 U.I./ml Sanofi 5 ml vial
HEPES Sigma H3375 final 10 mM
High speed rotary micromotor kit Foredom K.1070 maximum drill speed 38,000 rpm
Internal solution compounds :
Isolated Pulse Stimulator A-M Systems 2100
KCl Sigma P4504 final 1,2 mM
Ketamine 1000 Virbac
Ketofen 10% Merial 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%)
Laocaine (lidocaine) MSD 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%)
LED hi power spot for surgery Photonic (via Phymep) 10044
LED Power Supply Cairn Research OptoLED Light Source
Manipulators Luigs & Neumann SM-7
Mg-ATP 2H20 Sigma A9187 final 4 mM
MgCl2 Sigma 63069 final 2 mM
Micro temperature controler Physitemp MTC-1
Milk powder Carnation
MultiClamp 700B Axon Instruments
Na Phosphocreatine Sigma P7936 final 10 mM
Na3-GTP 2H20 Sigma G9002 final 0.4 mM
needle holder/hemostat FST 13005-14
pClamp acquisition software Axon Instruments
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3 14-16 on the display for 2-3 ml/min 
Potassium gluconate (K-gluconate) Sigma G4500 Final 135 mM
ProLong Gold antifade mounting medium Thermofisher Scientific P36390
Rompun 2% (xylazine) Bayer
small scissors FST 14060-09
Sodium chloride 0.9%  Virbac dilute 8.5 mL in 10 ml total
Stereomicroscope VISISCOPE SZT VWR 630-1584
Stereotaxic frame with digital display Kopf Model 940 Small animal stereotaxic instrument
Streptavidin-Cy3 conjugate Life technologies  434315
Streptavidin-Cy5 conjugate Thermofisher Scientific S32357
Superglue3 Loctite Dutscher 999227 1g tube
Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid Ethicon F3210
Syringe pump kdScientific Legato 130 – 788130 Use Infuse and Withdraw modes
Tissue slicer Leica VT1200S speed 0.07, amplitude 1.
tubing Gilson F117942, F117946 Yellow/Black, Purple/Black
upright microscope Olympus BX51W1
Versi-dry bench absorbant paper Nalgene

References

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Citer Cet Article
Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. J. Vis. Exp. (151), e59534, doi:10.3791/59534 (2019).

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