Summary

Cultivo celular bacteriano en el nivel de una sola célula dentro de las vesículas gigantes

Published: April 30, 2019
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Summary

Demostramos el cultivo monocelular de bacterias dentro de vesículas gigantes (GV). Los GV que contenían células bacterianas fueron preparados por el método de transferencia de gotas y fueron inmovilizados sobre una membrana apoyada sobre un sustrato de vidrio para la observación directa del crecimiento bacteriano. Este enfoque también puede ser adaptable a otras células.

Abstract

Desarrollamos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de vesículas gigantes (GV). El cultivo celular bacteriano es importante para entender la función de las células bacterianas en el medio natural. Debido a los avances tecnológicos, varias funciones celulares bacterianas se pueden revelar a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado. Los GV son compartimentos esféricos de tamaño micro compuesto por moléculas de lípidos anfifílicos y pueden contener diversos materiales, incluidas las células. En este estudio, una sola célula bacteriana fue encapsulada en 10-30 m de GV por el método de transferencia de gotas y los GV que contienen células bacterianas fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un sustrato de vidrio. Nuestro método es útil para observar el crecimiento en tiempo real de bacterias individuales dentro de los GV. Cultivamos células escherichia coli (E. coli) como modelo dentro de los GV, pero este método se puede adaptar a otros tipos de células. Nuestro método se puede utilizar en los campos científico e industrial de la microbiología, la biología, la biotecnología y la biología sintética.

Introduction

El cultivo de células bacterianas a nivel de una sola célula ha recibido cada vez más atención. Cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de un espacio confinado puede dilucidar funciones bacterianas como la variabilidad fenotípica1,2,3,4, comportamiento celular5, 6 , 7 , 8 , 9, y resistencia a los antibióticos10,11. Debido a los recientes avances en las técnicas de cultivo, el cultivo de bacterias individuales se puede lograr dentro de un espacio confinado, como en un bien-chip4,7,8, gota de gel12,13 , y gota de agua en aceite (W/O)5,11. Para promover la comprensión o la utilización de células bacterianas individuales, se necesitan desarrollos técnicos adicionales de las técnicas de cultivo.

Las vesículas que imitan la membrana celular biológica son compartimentos esféricos que consisten en moléculas anfifílicas y pueden contener diversos materiales. Las vesículas se clasifican según el tamaño e incluyen vesículas pequeñas (SVs, diámetro < 100 nm), vesículas grandes (LV, 1 m). SVs o LV se utilizan comúnmente como portadores de drogas debido a su afinidad con la membrana celular biológica14. Los GV también se han utilizado como sistema de reactores para la construcción de protocélulas15 o células artificiales16. La encapsulación de células biológicas en GV se ha reportado17,18, y por lo tanto los GV muestran potencial como un sistema de cultivo celular cuando se combina con el sistema del reactor.

Aquí, junto con un video de procedimientos experimentales, describimos cómo los GV pueden ser utilizados como nuevos buques de cultivo celular19. Los GV que contenían bacterias fueron fabricados por el método de transferencia de gotas20 y luego fueron inmovilizados en una membrana apoyada en un vidrio de cubierta. Utilizamos este sistema para observar el crecimiento bacteriano a nivel de una sola célula dentro de los GV en tiempo real.

Protocol

1. Preparación de LOS GV que contienen células bacterianas por el método de transferencia de gotas Preparar soluciones de stock de lípidos de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) y 1,2-distearoyl-sn-glicero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] (biotina-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) en cloroformo/ metanol (2/1, v/v) y almacene el stock a -20 oC. Preparación de una solución de aceite que contenga lípidos Vierta 20 ml de la …

Representative Results

Presentamos un método sencillo para generar GV que contengan células bacterianas individuales utilizando el método de transferencia de gotas (Figura 1). La Figura 1a muestra una imagen esquemática de la precipitación de los GV que contienen bacterias. Las gotas W/O que contienen bacterias se transfieren a través de la interfaz de agua de aceite (monocapa lipídica) por centrifugación para formar GV. La diferencia de densid…

Discussion

Aquí, describimos un método para cultivar células bacterianas a nivel de una sola célula dentro de los GV. Este método simple implica la formación de GV que contienen células bacterianas a nivel de una sola célula mediante el método de transferencia de gotas. En comparación con otros enfoques para la obtención de GV que contienen células bacterianas, este método tiene dos ventajas: (i) es fácil de desarrollar, y (ii) se requiere un pequeño volumen (2 l) de la solución de la muestra para preparar los GV. E…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una Iniciativa Líder para Excelentes Investigadores Jóvenes (LEADER, No. 16812285) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT) de Japón, una Beca en Ayuda para la Investigación de Jóvenes Científicos (No 18K18157, 16K21034) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) a M.M., y la Beca en Ayuda de MEXT a K.K. (No 17H06417, 17H06413).

Materials

Bactotryptone BD Biosciences 211705
Chloroform Wako Pure Chemicals 032-21921
Cover glass (18 × 18 mm) Matsunami Glass Ind. C018181 thickness 0.13–0.17 mm
Cover glass (30 × 40 mm) Matsunami Glass Ind. custom-order thickness 0.25–0.35 mm
Desktop centrifuge Hi-Tech Co. ATT101 swing rotor type
Double-faced seal (10 × 10 × 1 mm) Nitoms T4613
Glass vial AS ONE 6-306-01 Durham fermentation tube
Glucose Wako Pure Chemicals 049-31165
Inverted microscope Olympus IX-73
Methanol Wako Pure Chemicals 133-16771
Microscopic heating stage system TOKAI HIT TP-110R-100
Mineral oil Nacalai Tesque 23334-85
Mini-extruder Avanti Polar Lipids 610000
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Objective lens Olympus LUCPLFLN 40×/0.6 NA
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids 610005 pore size 100 nm
sCMOS camera Andor Zyla 4.2 plus
Sodium chloride Wako Pure Chemicals 191-01665
Sucrose Wako Pure Chemicals 196-00015
Ultrasonic bath AS ONE ASU-3D
Yeast extract BD Biosciences 212750
0.6 mL lidded plastic tube Watson 130-806C
1.5 mL lidded plastic tube Sumitomo Bakelite Co. MS4265-M
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline Avanti Polar Lipids 850457P POPC
1,2-distearoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] Avanti Polar Lipids 880129P Biotin-PEG-DSPE

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Citer Cet Article
Morita, M., Ota, Y., Katoh, K., Noda, N. Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles. J. Vis. Exp. (146), e59555, doi:10.3791/59555 (2019).

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