Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.
Proteinli Self-montaj protein fonksiyonunu yönetir ve uzay ve zamanda hücresel süreçleri bölümlere ayırarak. Düşük hassasiyet, dolaylı okuma-çıkışları, sınırlı verim ve/veya tek hücreli çözünürlük yerine nüfus düzeyinde etkilenmesini incelemek için geçerli Yöntemler. Tüm bu sınırlamaları ele alan bir akış sitometri tabanlı tek metodoloji tasarladık: dağıtılmış Amphifluoric FRET veya DAmFRET. DAmFRET algılar ve hassasiyetli emisyon FRET in vivo tarafından protein kendinden montajları nicelik, model sistemleri arasında dağıtım sağlar-Maya insan hücrelerine-ve hassas elde, tek hücreli, yüksek verim okuma-çıkışları ne olursa olsun protein Yerelleştirme veya çözünürlüğe.
Homotipik protein etkileşimlerini incelemek için, ya da “kendi kendine montaj” önemlidir çünkü Oligomerik devlet ve proteinlerin çözünürlüğünü işlevlerini dikte. Proteom homo-multimers1,2,3,4ile doludur, nispeten az protein monomerler olarak işlev ancak. Proteinler ayrıca stres, Yaş veya yanlış düzenleme nedeniyle, Faaliyetteki patolojik değişikliklere yol açan bir şekilde birleştirilebilir. Bu tür olaylar, hatta montajların fiziksel doğası modüle faktörleri tanımlamak, genellikle son derece zordur.
Protein artan sayıda artık kendi kendine olağanüstü kooperatiflik ve belirsiz stoichiometri ile birleştirmek için tanınır, diğer hücresel bileşenlerden kendi demixing sonuçlanan, proteinin yoğun faz olarak. Bunlar, damlacıklar ve jeller gibi düzensiz yoğuşanlar veya amiloid lifleri gibi yüksek sipariş edilen filam formları alır. İkincisi ile ilgili Konformasyonel dalgalanmalar ilk oluşumu, veya nükle, doğal olarak moleküler düzeyde5,6olasılıksal render. Çünkü çekirdeklenme olasılığı hacim ile ölçekler, bu tür montajların oluşumu son derece Stokastik yaşam hücrelerinin uzamsal sınırlar içinde olabilir7,8. Stokastik nüklinin aşırı-sınırlı faz ayrımı Prions, sadece nadiren kendiliğinden nükstür yüksek sipariş protein meclisleri, ancak bir kez oluşmuş, sonsuza kadar kendi büyüme şablonu. ASC olarak bilinen bu tür bir protein, memelinin doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin aktivitesinde dijital prion benzeri bir anahtar yürütür. ASC Self-montajı, bağlayıcı patojen veya tehlikeyle ilişkili moleküler desenler üzerine oligomerize olan spesifik proteinlerle etkileşimi ile çekirdeklenmiş. ASC derlemeleri sırayla nüksleme procaspase-1 kendi kendine birleştirmek ve etkinleştirmek için, hücrenin sitokin olgunlaşma ve pyroptosis yol9,10. ASC ‘in montajdan sorumlu bölgesi, insan proteomunda 100 ‘ den fazla üyeden oluşan ölüm alanı süper ailesine aittir. Doğuştan gelen bağışıklık ve programlanmış hücre ölümü ölüm etki alanlarının önemli rolleri rağmen, çoğu henüz kendi kendine saygı ile karakterize değil-montaj. Bu tür davranışlara sahip ek proteinlerin keşfi ve karakterize edilmesi, protein kendi kendine montajının doğrudan, tek hücreli bir okunmasıyla büyük ölçüde kolaylaştırılır.
Boyut-dışlama Kromatografi ve ultrakentüklasyon gibi protein kendi kendine montajını incelemek için klasik protein biyokimyası yaklaşımlar büyük ölçüde nüfus düzeyi değerlendirmelerini sınırlıdır. Ancak, çekirdekleme sınırlı Faz geçişleri kaynaklanan hücre-hücre heterojenlik bu ayrıntı düzeyi ile modellenemez. Floresan mikroskopiye dayanan tek hücreli yaklaşımlar bu yeteneği yeniden kazanmaktadır, ancak çekirdekleri doğru şekilde ölçmek veya nadir montajları tespit etmek için gerekli verim eksikliği. Dahası, çoğu enzimler ve önceden amiloid oligomers gibi çözünür Self-montajlar, standart ışık mikroskobu ile çözülmesi için çok küçük ve mobil. Floresan korelasyon spektroskopisi gibi daha sofistike yaklaşımlar ile tespit edilebilir, ancak bunlar hücre numarası ve verimi ile çok sınırlıdır.
FRET ve bölünmüş fluorophore complementation gibi protein montajında yakınlık tabanlı asder, bu sorunlara potansiyel bir çözüm sunar. Ancak, genellikle iki farklı yapıları tamamlayıcı etiketleri için erimiş faiz protein ifade kullanımı gerektirir-donör ve FRET durumunda alıcı fluorophores. Bu, deneysel verimi tehlikeye atmakta ve aynı zamanda, donör ve alıcısı göreli düzeylerde hücre-hücre varyasyonu nedeniyle duyarlılık azaltır. Bunu aşmak için, biz bir photoconvertible fluorophore istihdam bir tahlil tasarlanmış, mEos 3.111, tek bir yapı hem donör ve Acceptor etiketli protein ifade sağlar. Dönüştürülmüş mEos 3.1 (GFP-benzeri donör) emisyon spektrumunu yeterli fotodönüştürülmüş mEos 3.1 (dsRed-gibi Acceptor) uyarma spektrum ile çakışıyor moleküller yakın olduğu zaman FRET gerçekleşmesi için izin (< 10 Nm). Böylece, 405 nm ışık bir ampirik olarak belirlenen dozda hücreleri göstererek, hangi fotodönüştürür toplam mEos 3.1 optimum fraksiyonu alıcı formu içine, biz birden fazla numune boyunca donör ve Acceptor tutarlı ve tekrarlanabilir göreli seviyeleri elde, ifade düzeyleri ve deneyler. 561 nm ışık veya dolaylı olarak (donörden enerji transferiyle) 488 nm ışık (yani, hassaslaştırılmış emisyon FRET) ile doğrudan heyecanlı olduğunda alıcı floresans ölçmek. Protein montajını bu iki değerin oranı ve amphifluorik FRET veya Ayfret terimi olarak bildiriyoruz.
Akış sitometrisi ile protein konsantrasyonunu hesaplamak için, ilk olarak mEos 3.1 ile etiketlenmiş Spc42 ortalama floresan yoğunluğunu hesaplıyoruz. Maya hücreleri Spc42 yaklaşık 1000 molekülleri içerdiğinden, daha sonra tek bir floresan yeşil mEos 3.1 molekül floresan yoğunluğu hesaplamak. Tüm hücresel konsantrasyonlarda bile photoconversion yararlanarak (Şekil 1E), biz daha sonra fotodönüşüm aşağıdaki tüm Acceptor yoğunlukları Için toplam MEOS 3.1 floresans değerleri ilişkilendirir. Daha sonra yaklaşık sitosolik hacim (görüntüleme akışı sitometrisi kullanılarak belirlendiği gibi) ile floresan proteinlerin toplam sayısını bölebiliyoruz ve bu da faiz proteininin toplam siterik konsantrasyonunu elde eder. Tam hesaplamalar için lütfen orijinal makalenin8‘ ine bakın.
MEos 3.1-Fused protein Maya bir 2Μ plazmid ifade ederek, her örnek8protein konsantrasyonu yaklaşık bin kat aralığı prob. Biz transfeksiyon sırasında Plasmid Alım varyasyon nedeniyle HEK293T hücrelerde aynı elde, ve bu nedenle değişken kopya numarası.
En fazla binlerce hücre için, Ayfret veya DAmFRET dağılımı, her türlü ilgi proteini için siterin kendi kendine montajının konsantrasyonu-bağımlılığını ortaya çıkarır. Genel olarak, DAmFRET bulmak ve duyarlılık, verim ve yeniden Üretilebilirlik görülmemiş bir kombinasyonu ile protein Self-montajı karakterize etmek için bir etkinleştirme metodolojisi temsil eder.
Bir görüntüleme sitometresi kullanırken bizim vivo protein konsantrasyonu ölçümleri elde etmek için bize sağlar, bu tür sitometreler henüz çoğu araştırma kurumlarında mevcut değildir. Yine de, damfret protein ifadesi aralığında protein montajı dağıtımları almak için tipik olmayan bir görüntüleme sitometresi bile çalıştırılabilir.
DAmFRET, protein kendi kendine montajı içinde vivo algılamak için en kapsamlı yöntemdir. DAmFRET, tek hücreli çözünürlük ve yüksek verim ile geniş bir konsantrasyon yelpazesi üzerinde homotipik protein-protein etkileşimlerini doğrudan okuma-dışarı birleştirir. Damfret doğrudan okuma-out ve erimiş proteinler belirli bir hücre altı lokalizasyonu veya çözünmez devlet gerektirmez gerçeği yanlış pozitifleri ortadan kaldırır ve kendi yerel alt hücresel konumlarda proteinlerin geniş bir yelpazede uygulanabilirliğini genişletir. Özellikle, T-Sapphire ve mcardinal gibi MEOS 3.1 ile ışıksal uyumlu fluorophores ile organelleri etiketleme ile, çözünür ve Proteinler montajlı formları hücre altı lokalizasyonu damfret ile birlikte tespit edilebilir.
Burada açıklandığı gibi görüntüleme akışı sitometresi kullanarak, yaklaşık 20.000 Gated hücreleri ile bir 96-kuyu plaka analiz etmek için 8 h alır iyi. Ancak, ayrıca rutin olarak çok daha yüksek verim (dakikada 20 numunelere kadar) elde standart (olmayan görüntüleme) cytometre ile DAmFRET gerçekleştirin. Aslında, herhangi bir akış sitometresi ile dağınık olarak ayrılmış 488 ve 561 nm lazerler günlük amfi eserler ücretsiz ve uygun Pmts ve filtre donör algılamak için vardır, fret, ve Acceptor sinyalleri damfret gerçekleştirmek için yeterlidir. Şu anda, verimlilik bu kazanç yerelleştirme bilgi ve hacim belirlenmesi pahasına gelir, kendi kendine montaj daha sonra konsantrasyon yerine protein ifadesi bir fonksiyon olarak analiz edilmelidir gibi. Bu niteliksel analizler için bir sorun değildir. Ayrıca, ışıksal farklı bir fluorophore ile ifade sıkıca sitenik hacim ile ilişkilendirir endojen “temizlik” proteini eritme sitosolik hacminin tahmin etmek mümkün olabilir.
Hem Maya ve memelide hücrelerde DAmFRET bizim dağıtım aracılığıyla göstermiştir gibi, DAmFRET kolayca farklı ifade sistemlerine adapte edilebilir. Bu da kendi doğal hücresel bağlamlarında incelenecek proteinlerin kendi kendine montajını sağlar. Ayrıca, protein kendi kendine montajı yöneten mekanizmaların korunmasını incelemek için yaygın olarak farklı hücre-kültür modelleri arasında protein montajı karşılaştırmak için yeteneği sunuyor.
The authors have nothing to disclose.
Biz Jeff Lange, Jay Unruh, Jianzheng Wu, Tarique Khan ve Ellen Ketter tahlil gelişimi yönünde çalışmaları için teşekkür etmek istiyorum. Bu iş, kısmen, T.S.K. ve A. R. G için doktora tezi araştırmaları için açık üniversite, INGILTERE ve Stowers Enstitüsü Tıp araştırma lisansüstü Okulu, ABD, sırasıyla kayıtlı olarak ihtiyaçlarını yerine getirmek için yapıldı. Ek tahlil ile ilgili bilgiler https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016 adresinde bulabilirsiniz. Bu yazıda temel alınan orijinal veriler http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372 adresinde bulunan Stowers Original veri deposundan erişilebilir. Bu çalışma NıH yönetmen erken bağımsızlık Ödülü DP5-OD009152, Mart Dimes Vakfı Grant No 5-FY17-32 ve Stowers Enstitüsü tıbbi araştırma tarafından finanse edildi.
Yazar Katkıları aşağıdaki gibidir. Kavramsallaşma: T.S.K., SV ve bağıl nem; Metodoloji: T.S.K., SV, A.R.G., ve A. B; Soruşturma: SV, T.S.K. ve A.R.G.; Resmi analiz: SV ve T.S.K.; Veri Kürasyonu: T.S.K.; Görselleştirme: T. S. K ve SV, yazma (orijinal Draft): SV ve T.S.K.; Yazma (Inceleme, düzenleme): bağıl nem, SV ve T.S.K.; ve finansman edinme: bağıl
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |