توضح هذه المقالة بروتوكول قياس التدفق المستندة إلى FRET لتحديد حجم التجميع الذاتي للبروتين في كل من خلايا S. cerevisiae و HEK293T.
تحكم عملية التجميع الذاتي للبروتين وظيفة البروتين وتقسم العمليات الخلوية في المكان والزمان. وتعاني الأساليب الحالية لدراستها من انخفاض الحساسية، والقراءة غير المباشرة، والإنتاجية المحدودة، و/أو مستوى السكان بدلا ً من حل الخلية الواحدة. لقد قمنا بتصميم منهجية واحدة تعتمد على قياس التدفق والتي تعالج جميع هذه القيود: الاتحاد اتف توزيعه أمفيفلوريك FRET أو DAmFRET. DAmFRET بالكشف عن وكمية التجمعات الذاتية للبروتين عن طريق الانبعاثات الحساسة FRET في الجسم الحي، وتمكن من النشر عبر أنظمة نموذجية- من الخميرة إلى الخلايا البشرية، ويحقق القراءة الحساسة، خلية واحدة، عالية الإنتاجية بغض النظر عن البروتين التعريب أو الذوبان.
الاختبارات لدراسة تفاعلات البروتين المتجانسة، أو “التجميع الذاتي” مهمة لأن الدولة القلة وذوبان البروتينات تملي وظيفتها. البروتيوم تكثر مع الإنسان الملتف1،2،3،4،في حين أن عدد قليل نسبيا من البروتينات تعمل كمونومرات. البروتينات يمكن أيضا تجميع شاذة بسبب الإجهاد, العمر, أو سوء التنظيم, مما يؤدي إلى التغيرات المرضية في النشاط. وغالبا ً ما يكون تحديد العوامل التي تعدل مثل هذه الأحداث، أو حتى الطبيعة المادية للتجمعات، أمراً صعباً بشكل استثنائي.
وهناك الآن عدد متزايد من البروتينات المعترف بها لتجميع الذات مع التعاون غير عادية والقياس غير محدد، مما أدى إلى إزالة الاختلاط من المكونات الخلوية الأخرى، ومراحل كثيفة البروتين. هذه تأخذ شكل المكثفات المختلة، مثل قطرات والمواد الهلامية، أو خيوط مرتبة للغاية، مثل ألياف الأميلويد. التقلبات المطابقة المرتبطة بهذا الأخير تجعل تشكيلها الأولي، أو النوى،بطبيعتها الاحتمالية على المستوى الجزيئي 5،6. لأن احتمال موازين النوى مع الحجم، وتشكيل مثل هذه التجمعات يمكن أن يكون مؤشر ستوكاستيك للغاية في الحدود المكانية للخلايا الحية7،8. في أقصى حد من الفصل المرحلة النويات العشوائية هي prions، جمعيات البروتين أمر للغاية التي نادرا ما نواة تلقائيا، ولكن مرة واحدة شكلت، قالب نموها الخاص إلى أجل غير مسمى. أحد هذه البروتينات، المعروف باسم ASC، ينفذ مفتاح رقمي يشبه prion في نشاط الخلايا المناعية الفطرية الثدييات. يتم تمركز التجميع الذاتي ASC من خلال تفاعلها مع بروتينات محددة التي لديها نفسها oligomerized على ربط مسببات الأمراض أو الأنماط الجزيئية المرتبطة بالخطر. جمعيات ASC بدورها النوى procaspase-1 لتجميع ذاتي وتفعيل، مما يؤدي إلى نضج السيتوكينوpyroptosis من الخلية 9،10. ينتسب المنطقة من [أسك] مسؤولة لجمعيته إلى الموت مجال [سوبربمنت], أيّ يتألّف على [أن-هوندرد] أعضاء في ال [بروتيوم] إنسانيّة. وعلى الرغم من الأدوار المحورية لمجالات الموت في الحصانة الفطرية وموت الخلايا المبرمج، فإن معظمها لم يُميّز بعد فيما يتعلق بالتجمع الذاتي. سيتم تسهيل اكتشاف وتوصيف بروتينات إضافية مع مثل هذا السلوك إلى حد كبير من خلال قراءة مباشرة من خلية واحدة من البروتين التجميع الذاتي.
وتقتصر نُهج الكيمياء الحيوية للبروتين الكلاسيكي لدراسة التجميع الذاتي للبروتين، مثل الكروماتوغرافيا والكروماتوغرافيا ذات الضخامة، إلى حد كبير على تقييمات مستوى السكان. ومع ذلك، لا يمكن نمذجة عدم تجانس الخلايا إلى الخلية الناتج عن عمليات الانتقال في المرحلة المحدودة للنواة بالنوى مع هذا المستوى من التفاصيل. وتستعيد نُهج الخلايا الواحدة القائمة على التنظير المجهري الفلوري هذه القدرة، ولكنها تفتقر إلى الإنتاجية اللازمة لتحديد حجم النوى بدقة أو للكشف عن التجميعات النادرة. وعلاوة على ذلك، فإن التجميعات الذاتية القابلة للذوبان مثل معظم الإنزيمات وoligomers ما قبل الأميلويد، صغيرة جداً ومتحركة بحيث لا يمكن حلها عن طريق الفحص المجهري الضوئي القياسي. ويمكن الكشف عنها من خلال نُهُج أكثر تطوراً مثل التحليل الطيفي لارتباط الفلورة، ولكن هذه النُهُج محدودة جداً من حيث عدد الخلايا والإنتاجية.
وتوفر الاختبارات القائمة على القرب لتجميع البروتين، مثل فريت وتكملة الفلوروفور المقسمة، حلاً محتملاً لهذه المشاكل. ومع ذلك، فإنها تتطلب عموما استخدام اثنين من المنشآت المختلفة التي تعبر عن البروتين من الاهتمام تنصهر إلى العلامات التكميلية- المانح والمقبول الفلوروفورفية في حالة فريت. وهذا يعرض الإنتاجية التجريبية للخطر ويقلل أيضا من الحساسية بسبب التباين من خلية إلى خلية في المستويات النسبية للمانح والمقبول. للتحايل على هذا، قمنا بتصميم تحليل يستخدم فلوروفور قابل للتحويل الضوئي، mEos3.111، والذي يسمح لتشييد واحد للتعبير عن كل من البروتين المانح والمقبول الموسومة. يتداخل طيف الانبعاثات لـ mEos3.1 غير المحول (متبرع يشبه GFP) بشكل كافٍ مع طيف الإثارة لـ mEos3.1 (مقبل يشبه dsRed) للسماح بحدوث FRET عندما تكون الجزيئات على مقربة (<10 نانومتر). وهكذا، من خلال تعريض الخلايا لجرعة محددة تجريبيا من 405 نانومتر الضوء، الذي photoconverts جزء الأمثل من مجموع mEos3.1 في شكل مقبول، ونحن نحقق مستويات نسبية متسقة واستنساخ من الجهات المانحة ومقبول عبر عينات متعددة، مستويات التعبير، والتجارب. نحن قياس الفلورية مقبول عندما متحمس إما مباشرة مع 561 نانومتر ضوء، أو بشكل غير مباشر (عن طريق نقل الطاقة من المانح) مع 488 نانومتر ضوء (أي، حساسة الانبعاثات FRET). نحن نبلغ تجميع البروتين كنسبة من هاتين القيمتين والمصطلح هو AMPHIfluoric FRET أو AmFRET.
من أجل حساب تركيز البروتين عن طريق قياس التدفق، نقوم أولا بحساب متوسط كثافة الفلورة من Spc42 الموسومة mEos3.1. لأن خلايا الخميرة تحتوي على ما يقرب من 1000 جزيئات من SPC42، ونحن ثم حساب كثافة الفلورة من جزيء واحد الفلورسنت الأخضر mEos3.1. من خلال الاستفادة من تحويل الصور حتى في جميع التركيزات الخلوية (الشكل1E)،ونحن ثم ربط مجموع قيم الفلورة mEos3.1 لجميع كثافة مقبول بعد تحويل الصور. نحن بعد ذلك قادرون على تقسيم العدد الإجمالي للشامات من البروتينات الفلورية من قبل حجم السيتوسولية التقريبي (كما هو محدد باستخدام التصوير تدفق القياس الدوري) للحصول على التركيز الدوري الكلي للبروتين من الفائدة. للاطلاع على الحسابات الدقيقة، يرجى الاطلاع على المخطوطة الأصلية8.
من خلال التعبير عن البروتين mEos3.1 تنصهر من بلازميد 2μ في الخميرة، ونحن التحقيق في مجموعة ما يقرب من ألف أضعاف من تركيز البروتين في كل عينة8. نحن نحقق نفس الشيء في خلايا HEK293T بحكم الاختلاف في التناول بلازميد أثناء التغوط، وبالتالي رقم نسخة متغير.
التوزيع الناتج من AmFRET، أو DAmFRET، لعدة آلاف من الخلايا يكشف عن تركيز الاعتماد على التجميع الذاتي في السيتوسول لأي بروتين من الفائدة. بشكل عام، يمثل DAmFRET منهجية تمكينية لاكتشاف وتوصيف التجميع الذاتي للبروتين مع مزيج غير مسبوق من الحساسية، والإنتاجية، والقابلية للاستنساخ.
في حين أن استخدام مقياس السيتومتر التصويري يمكننا من الحصول على قياسات تركيز البروتين في الجسم الحي، فإن أجهزة قياس السيتومتر هذه ليست متاحة بعد في معظم مؤسسات البحوث. ومع ذلك، يمكن تشغيل DAmFRET حتى في مقياس السيتومتر غير التصوير نموذجية للحصول على توزيعات تجميع البروتين على مجموعة من التعبير البروتين.
DAmFRET هو الأسلوب الأكثر شمولا للكشف عن البروتين التجميع الذاتي في الجسم الحي. DAmFRET يجمع بين القراءة المباشرة للتفاعلات المتجانسة البروتين البروتين على مجموعة واسعة من التركيز، مع قرار خلية واحدة والإنتاجية العالية. القراءة المباشرة من DAmFRET وحقيقة أن البروتينات المنصهرة لا تتطلب توطين تحت الخلية محددة أو حالة غير قابلة للذوبان يلغي إيجابيات كاذبة ويمتد انطباقه إلى مجموعة واسعة من البروتينات في مواقعها الفرعية الأصلية. وتجدر الإشارة إلى أنه من خلال وضع علامات على العضيات ذات الفلوروفورات المتوافقة مع mEos3.1، مثل T-Sapphire وmCardinal، يمكن تحديد التوطين دون الخلوي لأشكال البروتينات القابلة للذوبان والمجمعة جنباً إلى جنب مع DAmFRET.
باستخدام مقياس تدفق التصوير كما هو موضح هنا، فإنه يأخذ 8 ساعة لتحليل لوحة 96 جيدا مع ما يقرب من 20،000 خلية مسورة في بئر. ومع ذلك، فإننا أيضا أداء بشكل روتيني DAmFRET مع قياس السيتومترات القياسية (غير التصوير) التي تحقق الإنتاجية أعلى بكثير (ما يصل إلى 20 عينة في الدقيقة الواحدة). في الواقع، أي تدفق مقياس السيتومتر مع الليزر 488 و 561 نانومتر مفصولة مكانيا خالية من القطع الأثرية أمبير سجل ويحتوي على PMTs المناسبة والمرشحات للكشف عن المانحة، فريت، وإشارات مقبول يكفي لأداء DAmFRET. في الوقت الحاضر، يأتي هذا المكسب في الإنتاجية على حساب معلومات التعريب وتحديد الحجم، بحيث يجب بعد ذلك تحليل التجميع الذاتي كدالة للتعبير البروتين يُعنى به بدلاً من التركيز. وهذه ليست مشكلة بالنسبة للتحليلات النوعية. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الممكن تقدير الحجم السيتوسي عن طريق دمج فلوروفور متميز طيفياً ببروتين “التدبير المنزلي” المحلي الذي يرتبط تعبيره ارتباطاً شديداً بحجم السيتوسول.
كما أظهرنا من خلال نشرنا لDAmFRET في كل من الخميرة وخلايا الثدييات، يمكن تكييف DAmFRET بسهولة مع أنظمة التعبير المختلفة. وهذا يمكّن من التجميع الذاتي للبروتينات لدراستها في سياقاتها الخلوية الأصلية. وعلاوة على ذلك، فإنه يوفر القدرة على مقارنة تجميع البروتين عبر نماذج زراعة الخلايا المتباينة على نطاق واسع لدراسة الحفاظ على الآليات التي تحكم تجميع البروتين الذاتي.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر جيف لانج، وجاي أونروه، وجيانتشنغ وو، وتاريك خان، وإلين كيتر على عملهم من أجل تطوير الإنعاب. وقد تم القيام بهذا العمل للوفاء، جزئيا، بمتطلبات البحث في رسالة الدكتوراه لT.S.K. وA.R.G كطلاب مسجلين في الجامعة المفتوحة، المملكة المتحدة، ومعهد أبراج للبحوث الطبية كلية الدراسات العليا، الولايات المتحدة الأمريكية، على التوالي. ويمكن الاطلاع على معلومات إضافية تتعلق بالفحص في https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. يمكن الوصول إلى البيانات الأصلية التي تستند إليها هذه المخطوطة من مستودع البيانات الأصلية في Stowers على http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. تم تمويل هذا العمل من قبل مدير المعهد الوطني للصحة جائزة الاستقلال المبكر DP5-OD009152، مارس من مؤسسة ديميس منحة رقم 5-FY17-32، ومعهد أبراج للبحوث الطبية.
وفيما يلي مساهمات المؤلفين. التصور: T.S.K., S.V., and R.H.; المنهجية: T.S.K., S.V., A.R.G., and A.B; التحقيق: S.V., T.S.K., and A.R.G.; التحليل الرسمي: S.V., and T.S.K. ; معالجة البيانات: T.S.K.; التصور: T.S.K, and S.V., Writing (Original Draft): S.V., and T.S.K.; الكتابة (مراجعة، تحرير): R.H., S.V., and T.S.K.; والحصول على التمويل: ر. ح.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |