렌티 바이러스는 낮은 부착 플레이트에 준비 인간의 의사에 유전자 침묵 중재
Summary
짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 운반하는 렌티바이러스에 의해 형화되는 분산된 인간 섬 세포로부터 유전자 변형된 인간 의사구성을 생성하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 쉽게 사용할 수있는 효소 및 배양 혈관을 활용하고, 쉽게 수행 할 수 있으며, 기능 및 형태 학적 연구에 적합한 유전자 변형 인간 의사 를 생산합니다.
Abstract
다양한 유전 도구는 당뇨병 연구를위한 췌도 유전자의 기능을 해부설치류의 췌도에서 유전자를 조절할 수 있습니다. 그러나 설치류 섬으로부터 얻은 데이터는 종 간의 섬 구조 및 기능의 잘 알려진 차이로 인해 인간 섬에 완전히 재현되거나 인체에 적용되지 않는 경우가 많습니다. 현재, 인간 적인 작은 섬의 유전자 발현을 조작하기 위하여 유효한 기술은 아주 제한됩니다. 아데노바이러스, 플라스미드 및 올리고뉴클레오티드에 의한 천체 섬으로의 이식유전자 도입은 종종 낮은 효율과 높은 독성을 갖는다. 낮은 효율은 고효율을 요구하는 온전한 작은 섬에 있는 유전자 다운조절 연구에서 특히 문제가 됩니다. 효소적으로 분산된 섬 세포가 슈도이슬이라고 불리는 스페로이드를 형성하는 배양에서 재집계되는 것으로 알려져 있다. 인간 섬 세포의 크기 조절 재연은 장기간 배양 후 동적 첫 번째 단계 인슐린 분비를 유지하고 독성이 낮은 렌티바이러스 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 효율적으로 도입할 수있는 창을 제공하는 의사 를 생성합니다. 여기서, 2개의 상업적으로 이용 가능한 멀티웰 플레이트를 사용하여 렌티바이러스 환전 후 인간 의사구성의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. 이 프로토콜은 쉽게 수행될 수 있으며 인간 아일렛 세포를 사용하여 인슐린 분비의 역동성및 유전자의 효율적인 하향 조절을 가능하게 한다. 따라서, 렌티바이러스 매개 유전자 변조를 가진 인간 의사세포는 인간 섬 세포 내의 유전자 기능을 평가하는 강력하고 다양한 모델을 제공한다.
Introduction
기능성 베타 세포 질량의 손실은 타입-1과 타입-2 당뇨병둘다를 위한 중앙 병리1입니다. 베타 세포는 췌도에서 인슐린의 생산자인 반면, 베타 세포와 비베타 세포 간의 통신은 인슐린 분비제2의 조절에 중요한 역할을 한다. 또한, 글루카곤 분비의 dysregulation는 당뇨병에 있는 고혈당증에 기여합니다3. 따라서, 췌도 내 세포의 유전자 발현을 조절하여 당뇨병에서 췌도 기능 장애의 발병 의 배후에 있는 기전을 해결하는 데 큰 관심이 있다. 형질전환 마우스를 포함하여 접근의 각종은 마우스 작은 섬의 유전자 발현을 조절하기 위하여 유효합니다. 그러나, 인간과 마우스 섬은 뚜렷한 내분, 세포 분포, 베타와 알파 세포의비율, 및 분비에 대한 반응을 보여준다 4. 따라서, 인간 췌도에서 유전자 기능의 직접적인 평가는 인간 췌도의 병리생리학을 이해하는 데 매우 중요하다.
아데노바이러스 벡터는 비분열 세포에서 의한 고효율의 형질전환으로 인해 시험관내에서 췌도를 트랜스듀서하는 데 가장 널리 사용되는 바이러스 벡터이다. 그러나, 아데노바이러스는 특히 인간 섬 5에서 효율적으로 작은섬의 중심부에 침투하지 않으며, 고용량6에서세포 독성이다. 비교적, 렌티바이러스 벡터는 세포독성이 적고 유사분열 후 세포의 염색체내로 외인성 유전자를 영구적으로 전달하여 유전자치료 7에 대해 널리 테스트된 비히클입니다. 그러나, 렌티바이러스가 그대로 인간 섬의 코어를 관통하는 능력도 제한되어, 따라서 효소 소화에 의한 부분분산이 요구되어감전 효율을 증가시킨다 8. 본래 인간 아일의 분산과 주의되는 것은 세포-세포-세포-매트릭스 통신의 중단이며, 이는 인간에서 포도당 항상성의 유지에 중요한 인슐린분비의 동적 조절을 손상시키는 9. 따라서, 인간 섬 모델에서 아일렛 기능의 동적 조절에 대한 유전자 변조의 영향을 평가하는 것이 어려웠습니다.
인간과 설치류 섬으로부터 분산된 섬 세포가 자율적으로 “의사”라고 불리는 작은 섬과 같은 구조로 재집계되는 것으로 알려져 있습니다. 슈도이스렛은 네이티브 아일렛10,11과유사한 베타 및 비베타 세포 분포를 보여준다. 또한, 장기 배양 후, 네이티브 아일렛은 점차적으로 강력한제 1 상 인슐린 분비를 잃게 5,10,11,12. 그러나, 의사이스렛은 동일한 배양 기간5이후 네이티브 아일렛에 비해 포도당에 반응하여 제1상 인슐린 분비의 더 나은 보존을 입증했다. 인슐린 분비의 더 나은 보존을 갖는 것 이외에, 낮은 부착 플레이트(11)에 있는 인간 적인 작은 세트 세포의 크기 통제한 재응계는 그들의 재응집에 의하여 lentivirus 벡터를 소개하는 기회의 창을 제공합니다 의사 입니다. 여러 연구는 렌티 바이러스 매개 전이와 결합 된 의사 이스틀릿의 유용성을 입증했다. Caton 등 13은 렌티바이러스를 발현하는 녹색 형광 단백질(GFP)의 도입이 비감염 대조군과 비교하여 쥐 의사에서 GFP의 균질발현을 달성하면서 인슐린 분비에 거의 영향을 미치지 않았다고 보고했다. 그(것)들은 또한 lentivirus13를통해 connexins 32, 36 및 43를 과발현하여 인슐린 분비에 다른 connexins의 특정 효력을 설명했습니다. 시판되는 96웰 초저부착플레이트로 제조된 인간 의사이슬렛은 렌티바이러스-매개된 전사 인자의 과발현이 정적 배양에 의해평가된 인슐린 분비를 향상시킨다는 것을 입증하였다 14. 최근, 96웰 초저부착플레이트로 제조된 인간 의사이스제임제는 글루코코키나제를 렌티바이러스 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 통해 글루코키나제를 하향조절하는 데 사용되었으며, 이는 포도당 자극인슐린 분비가 감소한다는 것을 입증하는 원리의 증거로서, KCl 자극된 인슐린 분비는5. 이 연구는 또한 인간의 의사가 유전자 발현 및 분비 프로파일에서 네이티브 아일렛과 유사하다는 것을 입증했으며, 더 나아가 아일렛 기능의조절을 해부하는 인간 의사들의 유용성을 뒷받침한다 5. 회음이 수행되지 는 않았지만, 최근 상용화 된 생체 공학 마이크로 웰 배양 판은 렌티 바이러스 트랜스덕션과 호환되며 우수한 인슐린을 나타내는 인간 의사 를 생산하는 것으로 보고되었습니다. 이식 후 생체외 및 생체내 분비물11. Lentiviral transduction과 결합된 인간 의사 형성은 인간 섬 병리생리학을 조사하는 간단하고 효율적인 접근법이며, 인간 아일레에서 기계론적 연구를 수행하는 귀중한 도구를 제공합니다.
현재 보고서에서는 상용 두 개의 플랫폼을 사용하여 렌티바이러스로 트랜스화된 인간 의사를 형성하는 프로토콜, 96웰 초저 부착 플레이트 및 마이크로웰 배양판이 제시된다. 둘 다 유전자 발현의 능률적인 변조를 달성하고 정적 배양 및 회수를 포함하여 다운스트림 평가에 호환되는 인간 의사 를 만듭니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서, 96웰 초저부착플레이트 또는 마이크로웰 배양판을 이용하여 렌티바이러스에 의해 트랜스화된 인간 의사를 생성하는 상세한 프로토콜이 제시된다. 가성이슬렛은 네이티브 인간 섬과 유사한 형태 및 분비 기능을 입증하는 것으로 보고되었으며 시험관내 5,11,18에서장기간 배양될 수 있다. 크기의 넓은 변화를 보여주는 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Y.I.에 건강의 국립 연구소에 의해 재정적으로 지원되었다 (R01-DK090490) Y.I.에 미국 당뇨병 협회 (1-17-IBS-132). J.A. 및 Y.I.는 이글스 당뇨병 연구 센터의 형제 순서에 의해 지원됩니다. A.B.는 국립 보건원 교육 교부금(T32NS45549)의 지원을 받고 있습니다. 저자는 희망의 도시 (2UC4DK098085)에서 NIDDK 자금 통합 섬 분배 프로그램 (IIDP)에 의해 제공되는 인간의 췌도를 활용.
Materials
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
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