Determinación de la densidad del conducto biliar en el hígado del ratón
Summary
Presentamos un método bastante simple y sensible para la cuantificación precisa de la densidad de las vías biliares en el hígado del ratón. Este método puede ayudar a determinar los efectos de los modificadores genéticos y ambientales y la eficacia de las terapias potenciales en modelos de ratón de enfermedades biliares.
Abstract
El ratón se utiliza ampliamente como un organismo modelo para estudiar enfermedades biliares. Para evaluar el desarrollo y la función del sistema biliar, se utilizan diversas técnicas, incluyendo la química sérica, el análisis histológico y la inmunomancha para marcadores específicos. Aunque estas técnicas pueden proporcionar información importante sobre el sistema biliar, a menudo no presentan una imagen completa de los defectos de desarrollo del conducto biliar (BD) en todo el hígado. Esto se debe en parte a la robusta capacidad del hígado del ratón para drenar la bilis incluso en animales con deterioro significativo en el desarrollo biliar. Aquí presentamos un método simple para calcular el número promedio de BDs asociados a cada vena porta (PV) en secciones que cubren todos los lóbulos de ratones mutantes/transgénicos. En este método, los hígados se montan y seccionan de manera estereotípica para facilitar la comparación entre varios genotipos y condiciones experimentales. Los BDse identifican mediante microscopía ligera de colangiocitos manchados de citoqueratina, y luego se cuentan y dividen por el número total de PV presentes en la sección hepática. Como ejemplo, mostramos cómo este método puede distinguir claramente entre ratones de tipo salvaje y un modelo de ratón del síndrome de Alagille. El método presentado aquí no puede sustituir a las técnicas que visualizan la estructura tridimensional del árbol biliar. Sin embargo, ofrece una manera fácil y directa de evaluar cuantitativamente el desarrollo de BD y el grado de formación de reacciones ductulares en ratones.
Introduction
El árbol biliar es una parte crítica del hígado de mamífero, permitiendo el paso de la bilis de los hepatocitos al intestino. Los conductos biliares intrahepáticos (BD) están formados por colangiocitos, que se diferenciande los hepatoblastos bipotenciales a través de la señalización Notch y TGF 1,2. La especificación adecuada y el compromiso de los colangiocitos y su ensamblaje en BDs maduros son críticos para el desarrollo del árbol biliar intrahepático. A medida que el hígado crece durante el desarrollo o después de la regeneración de órganos, el sistema biliar necesita desarrollarse a lo largo del hígado para asegurar el drenaje biliar adecuado. Además, una serie de enfermedades sindrómicas y no sindrómicas dan lugar a la escasez de LOS DE intrahepáticos3. Además, una serie de enfermedades hepáticas agudas y crónicas dan lugar a las llamadas reacciones ductulares en el hígado, que se definen como la presencia de un número significativo de células que expresan marcadores biliares pero no necesariamente surgen de células biliares o forma de patente BDs4. En el trastorno multisistema Síndrome de Alagille (ALGS), haploinsuficiencia del ligando Notch irregular1 (JAG1) resulta en mala formación de BD y colestasis5,6. Nuestro laboratorio demostró recientemente que una línea de ratón heterocigoto Jag1 previamente generada7 es un modelo animal de la escasez BD en ALGS8. En este modelo de ratón de ALGS, los colangiocitos todavía están presentes. Sin embargo, no se comprometen a incorporarse a los DE de patente8. Por lo tanto, el análisis del hígado en un modelo de escasez de BD requiere más que la presencia aparente o ausencia de colangiocitos. Es importante evaluar con precisión el grado en que los BDmaduros están presentes en el hígado.
En patología anatómica, existen métodos cuantitativos aceptados para evaluar si la escasez de BD existe9. Por ejemplo, los estudios sobre ALGS en pacientes humanos a menudo cuantifican la relación BD a vena porta (PV) mediante el análisis de al menos 10 vasos de portal por biopsia hepática9,10. El análisis de la forma y la presencia o ausencia general de LOS BD de patentes, combinados con la química sérica, pueden proporcionar información valiosa sobre el desarrollo de BD en ratones11,12,13. Sin embargo, los ratones pueden perder un número significativo de BDs con sólo un aumento modesto en el niveldebilirrubina sérica 8. En consecuencia, un método cuantitativo que evalúe el número de BD presentes por PV puede proporcionar una medida más directa del grado de escasez de BD en ratones. En un informe reciente, cuantificamos el número de BDs por PV en todos los lóbulos hepáticos y reportamos una disminución significativa en la relación BD a PV en Jag1+/– animales8. Durante el transcurso de nuestro análisis, nos dimos cuenta de que a pesar de la variación significativa en el grado de respuesta inflamatoria y reacciones ductulares, la relación BD a PV no muestra mucha variabilidad8. Además, la cuantificación de la relación BD a PV nos permitió demostrar que la eliminación de una copia del gen de la glicoseltransferasa Poglut1 en Jag1+/– los animales pueden mejorar significativamente su escasez de BD8. En un fondo Jag1+/+, la pérdida condicional de Poglut1 en las células musculares lisas vasculares da como resultado un aumento progresivo en el número de BD, que es modesto (20-30%) en P7 pero sehace prominente en adultos 8. Una vez más, esta técnica nos permitió mostrar que incluso en P7, el aumento de la densidad de BD en estos animales es estadísticamente significativo. Cabe destacar que el aumento de la densidad de BD en este genotipo a los cuatro meses de edad también se validó mediante el análisis de fundición de resina. 8 Estas observaciones y otros informes que midieron la densidad de BD en diferentes modelos de ratón ALGS14,15 nos llevaron a incorporar este método en nuestra estrategia general para analizar defectos biliares en varios mutantes y ratones transgénicos.
Aquí, detallamos una técnica sencilla que se puede utilizar para examinar el grado de escasez de BD en modelos de ratón de enfermedad hepática (Figura1). En este método, la co-tinción con marcadores de colangiocitos cytoqueratina (CK) 8 y CK19 (en adelante CK de amplio espectro, wsCK) se utiliza para visualizar BDs y cholangiocitos no incorporados en el hígado del ratón. Se añade un anticuerpo contra la actina muscular alfa-suave (-SMA) a la tinción para etiquetar los vasos. El análisis sistemático de la relación BD a PV en una sección que cubre todos los lóbulos hepáticos garantiza que se analice un gran número de PV para cada genotipo. Dado que nuestro método se basa en la cuantificación de BDs y PV en imágenes 2D, no es adecuado para estudiar los efectos de una mutación dada en la estructura 3D del árbol biliar o la integridad de los pequeños conductos biliares. Sin embargo, proporciona una estrategia simple y objetiva para que los investigadores evalúen el desarrollo biliar en el ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis del desarrollo y reparación de BD en ratones es una herramienta importante en el estudio de la patogénesis y el mecanismo de los trastornos colestásicos. Además, el desarrollo de nuevas terapias depende en parte de la creación de un fenotipo reproducible y preferiblemente cuantificable. El fenotipado actual en modelos de ratón generalmente implica química sérica, histología hepática e inmunostaining para marcadores específicos de tipo celular. Aunque estas técnicas generan información valiosa so…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01 GM084135 y R01 DK109982), un Premio de Pilot/Viabilidad del Centro Médico de Enfermedad Digestiva de Texas bajo NIH P30 DK56338, y un Premio Acelerador del Síndrome de Alagille La Fundación Médica.
Materials
| Isothesia (Isoflurane) | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Desiccator | Bel-Art | 16-800-552 | |
| 10% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | |
| 50mL tube | ThermoScientific | 339653 | |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2401 | |
| 95% Ethanol | Decon Laboratories | 2801 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| HistoChoice | VWR Life Sciences | H103-4L | clearing agent |
| Omnisette Tissue Cassette | Fisher HealthCare | 15-197-710E | |
| Macrosette | Simport | M512 | |
| Paraplast X-TRA | McCormick Scientific | 39503002 | Parrafin |
| Tissue Mold | Fisher Scientific | 62528-32 | |
| Microtome | Microm | HM 325 | |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Xylene | Fisher Scientific | C8H10 | |
| Tris-Based Antigen Retrieval | Vector Laboratories | H-3301 | |
| Pressure Cooker | Instant Pot | Lux Mini | |
| Mini Pap Pen | Life Technologies | 8877 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T. Baker | X251-07 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100) | J.T. Baker | X198-07 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | Antibody Registry ID AB531826 |
| anti-CK19 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-III | Antibody Registry ID AB2133570 |
| anti-αSMA | Sigma Aldrich | A2547, Clone 1A4 | |
| anti-rat-Alexa488 | ThermoFisher | A21208 | |
| anti-mouse-Cy5 | Jackson Immunoresearch | 715-175-151 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 22×50 micro cover glass | VWR Life Sciences | 48393 059 | |
| Fluorescence Microscope | Leica | DMI6000 B | |
| Kimwipes | Kimtech Science | 05511 | |
| VECTASHIELD | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade Mounting Medium |
References
- Zong, Y., et al. Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation. Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).
- Clotman, F., et al. Control of liver cell fate decision by a gradient of TGFβ signaling modulated by Onecut transcription factors. Genes & Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).
- Karpen, S. J. Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis. Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).
- Roskams, T. A., et al. Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).
- Oda, T., et al. Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome. Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).
- Li, L., et al. Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1. Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).
- Xue, Y., et al. Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1. Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).
- Thakurdas, S. M., et al. Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi). Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).
- Hadchouel, M. Paucity of interlobular bile ducts. Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).
- Emerick, K. M., et al. Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis. Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).
- Poncy, A., et al. Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts. Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).
- Hofmann, J. J., et al. Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome. Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).
- McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency. Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).
- Andersson, E. R., et al. Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations. Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).
- Loomes, K. M., et al. Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage. Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).
- Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).
- Skalli, O., et al. A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).
- Kamath, B. M., et al. A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).
- Mouzaki, M., et al. Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome. Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).
- Shiojiri, N. Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver. Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).
- Crawford, J. M. Development of the intrahepatic biliary tree. Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).
- Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis. Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).
- Schaub, J. R., et al. De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation. Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).
- Tanimizu, N., et al. Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice. Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).
- Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. 3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system. J Vis Exp. (68), e4272 (2012).
- Popper, H., Kent, G., Stein, R. Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury. J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).
- Yimlamai, D., et al. Hippo pathway activity influences liver cell fate. Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).
