Häri beskriver vi ett kirurgiskt ingrepp som visar hur man uppnår permanent ligering av vänster-främre fallande koronar artär hos möss. Denna modell är av hög relevans för att undersöka patofysiologin vid hjärtinfarkt och samtidiga biologiska processer.
Hjärtinfarkt (MI) och akuta kranskärlssjukdomar är bland de mest framträdande dödsorsakerna i befolkningen med västerländsk livsstil. Den murina modeller av mi med permanent ligering av vänster-främre fallande (lad) kranskärl nära härmar mi hos människor. Murina modeller gynnas av den omfattande genteknik som finns idag. Här föreslår vi en reproducerbar murina kirurgisk modell av hjärtinfarkt av permanenta LAD koronar ligation. Vår teknik omfattar anestesi med ketamin/xylazin som snabbt kan vändas genom administrering av en antagonist, intubation utan trakeotomi för mekanisk-assisterad ventilation, ventilation med tillämpning av extrinsic positiva End-expiratory tryck (PEEP) för att undvika alveolära kollaps, en thorakotomy metod som begränsar till de minsta kirurgiska lesioner gjorda till skelett muskler, och lung inflation utan thoracentesis. Denna metod är glest invasiva, reproducerbara och minskar efter operationen dödlighet och komplikationer.
Akut hjärtinfarkt (MI) är det allvarligaste uttrycket av ischemiska hjärtsjukdomar (IHD). IHD är den vanligaste orsaken till komorbiditeter och dödsfall i världen, särskilt i västerländska länder1. Följaktligen har den en enorm ekonomisk inverkan på hälso-och sjukvårdssystemen2. MI kännetecknas av ocklusion av en kranskärlssjukdom av aterosklerotisk plack och efterföljande gripandet av blodflödet i stora delar av hjärtmuskeln. Brist på syretillförsel i hjärtmuskeln leder till ischemisk död av kardiomyocyter. Detta patologiska tillstånd utlöser svar i ventrikulär vävnad som i slutändan leder till brister i ventrikulär funktioner, remodeling och hjärtsvikt3. MI är ett komplext patofysiologiskt tillstånd som involverar flera och intrikata biologiska processer som omfattar reglerad celldöd, respons på oxidativ stress, inflammation, sårläkning, fibros och ventrikulär remodeling. Några av dessa biologiska svar modelleras som enskilda processer in vitro-som nekrosinducerad frisättning av skadeassocierade molekylära mönster och tillhörande inflammatoriska svar4. Dessa förenklade modeller är nödvändiga för att förstå MI. Men endast en in vivo modell kan ge en realistisk bild av de biologiska processerna komplexitet som används som svar på MI.
Även om modeller av MI i större djur som svin kan närmare relatera till mänsklig patofysiologi av MI, är kraften i murina modellerna bosatt i de möjligheter som genteknik som är mer avancerad än i någon annan däggdjursarter. Andra icke-försumbara aspekter är den relativa låga kostnaden och enkelheten i den kirurgiska installationen.
Det är värt att nämna att modeller av ischemia-reperfusion av hjärtmuskeln kan uppvisar olika utfall än permanenta mi-modeller. Biologiska processer som den typ av celldöd engagerad, kvalitet/amplitud eller kinetik av inflammatoriska och sårläkning svar i myokardvävnaden kan variera beroende på modell5,6,7. Emellertid, detta protokoll av permanenta koronar ocklusion kan lätt anpassas för att få en ischa-reperfusion modell.
Denna metod är relevant för studier med anknytning till hjärtinfarkt utan reperfusion och möjliggör övervakning av patologiska processer som inträffar från koronar ocklusion (minuter) till sen fas hjärtinsufficiens (veckor) vid den lokala hjärt vävnaden och systemisk Nivåer.
Det första kritiska steget i detta förfarande är förvisso intubation. Vi använder den avtrummade inre nålen på en 16 G kateter som trakealtub. Vi rekommenderar inte att du använder den här inställningen med möss som väger mindre än 22 g. Med denna inställning kan det vara svårt att intubera möss ordentligt med mindre kroppsvikt utan att skada luftstrupen. En annan kritisk punkt är att begränsa snitt som gjorts till muskeln samtidigt utsätta luftstrupen och bröstkorgen. Att minska vävnadsskador är av stor betydelse, särskilt när man studerar inflammatoriska processer efter MI. Det är därför vi föredrar skonsam spridning av muskler och revben med pinps och upprullningsdon8,9. Vi använder inte elektriska cauterizer att kontrollera blödning10. Detta kan orsaka iatrogena brännskador och gynna infektioner. Både trauma och infektioner kan bias inflammatoriska Läs-outs. Tillämpning av en extrinsic Peep på 3 cm H2O genom att störta ventilations avgaserna i ett vatten rör gränser end-expiratory alveolära kollaps under thorakotomi. Lokalisering av LAD är ett annat kritiskt steg och man bör ha i åtanke att anatomin i hjärtats kranskärl kan variera beroende på stammen och genotyp av musen11. Det kräver viss erfarenhet för att visualisera pojken, men att placera suturen direkt 2-3 mm under den vänstra Atria som beskrivs i förfarandet skall möjliggöra en korrekt positionering av ligering. Omedelbar missfärgning av stora delar av den vänstra ventrikeln under suturen bekräfta noggrannheten. Slutligen, artificiellt tillämpa Auto-PEEP genom att blockera ventilations avgaser för 2-3 respiratoriska cykler under bröstet stängning möjliggör en övergående hyperinflation av lungan som hjälper jaga luften från brösthålan12. Vi avsiktligt inte utföra en thoracentesis som visas i 9,10. På så sätt begränsar vi risken för lung-och hjärtskador och undviker överdriven vävnadsskada eller perforering.
Myokardischemi-reperfusion (I/R) är en relaterad kirurgisk modell som härmar restaurering av koronar blodflödet som görs för att MI patienter i kliniker. Under i/R-modellen en övergående ocklusion av hjärtats kranskärl görs genom att dra åt en bit av slangen på lad för en varaktighet av 20 till 45 min8,13. Sedan ocklusion frigörs för att möjliggöra reperfusion av hjärtmuskeln för önskad varaktighet. Denna enkla modifiering tillämpas på vårt protokoll kan enkelt förvandla det till en i/R-modell4,8,14,15. Infarkt kan bekräftas genom ett blodprov för hjärtintroponin T8,10 eller ekokardiografi15.
MI skiljer sig från I/R-modellen eftersom reperfusion av sig själv inducerar en skada. MI inducerar mer vävnadsnekros och apoptos är mer uttalad i reperfused hjärtmuskeln5. Kinetik av inflammatoriska celler infiltration skiljer också mellan i MI och IR med en fördröjd myokardiell infiltration av immunceller i MI7. Storleksanpassa och placera av det hjärtområdet ska också skilja sig åt mellan permanent ligering och I/R modellerar15. Med detta i åtanke måste man vara försiktig med att välja en relevant modell eftersom I/R och permanenta MI-modeller inte är likvärdiga. En annan murina modell av hjärtinfarkt är kryoinfarkt modellen. Tillämpning av en kryogen sond på LV främre väggen inducerar frysning av ventrikulär vävnad och blodflödet arrest i LAD artären. Denna teknik skiljer sig dock från mi och I/R tekniker om timing och amplitud av remodeling och inflammatoriska reaktioner16,17.
Variabilitet är en begränsning som för alla kirurgiska ingrepp. Denna variation bygger på biologiska skillnader. Ett bra exempel är variationen i koronar arteriell arrangemang i möss11. Det förlitar sig också på försöksledaren färdigheter. Det är värt att nämna att adekvat utbildning av försöksledaren är obligatoriskt för att nå stabila resultat med denna modell. En välutbildad försöksledaren kan lätt producera-infarct storlekar som är reproducerbara (figur 3a-B). Dödligheten i modellen beror på placeringen av pojken, varaktigheten av experimenten (dagar, veckor), mus stam och genotyper. De typer av bedövningsmedel och smärtstillande läkemedel kan också påverka resultatet av experiment med förmodade kardioprotektiva eller kardiodepressant effekter. I våra händer har denna modell en global dödlighets grad på 25-30%. Denna dödlighet omfattar spontana dödsfall och uppoffringar före experimentets, oavsett stammar och experimentets varaktighet. De flesta av dödsfallen eller offret är mellan den andra och fjärde dagen efter operationen. Tillämpa en strikt smärt Lind rad och uppföljning av djuren kan minska dödligheten.
Här presenterar vi representativa resultat av-infarct storlek analyseras med TTC färgning och uttryck av protein och gener som är involverade i inflammatoriska eller fibrotiska processer i LV av Western blot och realtid PCR respektive (figur 3c-G). Det är också möjligt att mäta många av dessa parametrar genom enzymkopplad immunosorbent assay (ELISA) eller enzymatiska analyser. Naturligtvis, i enlighet med hypotesen som behöver testas, denna metod kan följas av någon funktionell analys av ultraljud, MRI eller intraventrikulär kateter mätning av tryck och volym. Det är också möjligt att extrahera hjärtat och ytterligare undersöka hjärt cellbiologi på isolerade celler. Sammantaget, den MI modell med permanent ligering av LAD kranskärl är särskilt användbar för att utvärdera inflammatoriska och fibrotiska processer, sårläkning och förändringar i hjärtats funktion efter hjärtinfarkt.
The authors have nothing to disclose.
Denna modell utvecklades med stöd av schweiziska National Science Foundation (bidrag 310030_162629 till LL) och avdelnings medel från tjänster av thoraxkirurgi och intensiv vårds medicin vid Lausanne universitetssjukhus. JL är mottagare av ett stipendium från Emma Muschamp Foundation. Vi erkänner det avgörande stödet för veterinärer och djuranläggningar personal vid universitetet för biologi och medicin vid Lausannes universitet. Vi tackar Dr Giuseppina Milano från tjänsten av hjärtkirurgi i Lausanne universitetssjukhus och Dr Alexandre Sarre från kardiovaskulär bedömning facilty av Lausanne University för deras tekniska tips.
1 CC Syringe, Omnifix-F | B. Braun | 9161406V | |
30G- Needle | BD Microlance 3 | 304000 | |
70% Ethanol | |||
Betadine 60 ml | MundiPharma | ||
Blunt Retractors | Fine Science Tools | 18200-09 | |
Castroviejo Needle Holder Straight with Lock | Roboz | RS-6416 | |
Cotton Swabs | Applimed SA | 6001109 | |
Dissecting Scissors, Curved | Aesculap | BC603R | |
Electrical Razor | Remington | HC720 | |
Glucose 5% B.Braun | B. Braun | 531032 | |
Hair Removal Cream, Veet | Silk & Fresh Tech. | 8218535 | |
Iris Dissecting Forceps Full Curved | Aesculap | OC022R | |
Ketasol 100 (100 mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN01AX03 | |
Micro Scissors, Curved Blunt/Blunt | Aesculap | FM013R | |
NaCl 0.9% B. Braun | B. Braun | 534534 | |
Short Fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
Silk Suture 5-0, BB | Ethicon | K880H | |
Silk Suture 6-0, P-1 | Ethicon | 639H | |
Silk Suture 7-0,BV-1 | Ethicon | K804 | |
Student Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
Student Fine Forceps-Angled | Fine Science Tools | 91110-10 | |
Surgical Gloves | Weitacare | 834301 | |
Surgical heating pad | Personalized setting | ||
Temgesic sol 0.3 mg/ml Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | N02AE01 | |
Tracheal tube inner needle of an 16G i.v. cat | Abbocath-T | G714-A01 | |
Universal S3 Microscope, OMPIMD | Zeizz | ||
Ventilator, MiniVent Model 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
Viscotears | Alcon | 1551535 | |
Xylasol (1mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN05CM92 |