Qui descriviamo una procedura chirurgica che mostra come ottenere una legatura permanente dell’arteria coronaria discendente sinistra-anteriore nei topi. Questo modello è di grande rilevanza per studiare la fisiofisiologia dell’infarto miocardico e i processi biologici concomitanti.
L’infarto miocardico (MI) e le malattie coronariche acute sono tra le principali cause di morte nella popolazione con stile di vita occidentale. I modelli murini di MI con legatura permanente dell’arteria coronaria discendente sinistra-anteriore (LAD) imitano da vicino MI negli esseri umani. I modelli Murine beneficiano della vasta ingegneria genetica oggi disponibile. Qui proponiamo un modello chirurgico murino riproducibile dell’infarto miocardico per legatura coronarica permanente LAD. La nostra tecnica comprende l’anestesia con chetamina/xilazina che può essere rapidamente invertita con la somministrazione di un antagonista, intubazione senza tracheotomia per la ventilazione assistita meccanica, ventilazione con applicazione di positivo estrinseco pressione end-expiratory (PEEP) per evitare il collasso alveolare, un metodo di toracotomia che limita le lesioni chirurgiche minime apportate ai muscoli scheletrici e l’inflazione polmonare senza toracenesi. Questo metodo è scarsamente invasivo, riproducibile e riduce la mortalità e le complicazioni post-chirurgiche.
L’infarto miocardico acuto (MI) è l’espressione più grave di malattie cardiache ischemiche (IHD). IHD sono la principale causa di morbilità e morte in tutto il mondo, soprattutto nei paesi occidentali1. Di conseguenza, ha un enorme impatto economico sui sistemi sanitari2. L’MI è caratterizzato dall’occlusione di un’arteria coronaria da parte della placca aterosclerotica e dal successivo arresto del flusso sanguigno in gran parte del miocardio. La mancanza di apporto di ossigeno nel miocardio porta alla morte ischemica dei cardiomiociti. Questa condizione patologica innesca risposte nel tessuto ventricolare che alla fine porta a carenze nelle funzioni ventricolari, rimodellamento e insufficienza cardiaca3 . L’MI è una complessa condizione patofisiologica che coinvolge processi biologici multipli e intricati che comprendono la morte regolata delle cellule, la risposta allo stress ossidativo, l’infiammazione, la guarigione delle ferite, la fibrosi e il rimodellamento ventricolare. Alcune di queste risposte biologiche sono modellate come singoli processi in vitro come il rilascio indotto dalla necrosi dei modelli molecolari associati ai danni e le risposte infiammatorie associate4. Questi modelli semplificati sono essenziali per comprendere l’MI. Tuttavia solo un modello in vivo può fornire un’immagine realistica della complessità dei processi biologici impegnati in risposta all’MI.
Anche se i modelli di MI in animali più grandi come i maiali possono essere più strettamente correlati alla fisiopatologia umana di MI, la potenza dei modelli murini risiede nelle possibilità offerte dall’ingegneria genetica che è più avanzata che in qualsiasi altra specie di mammiferi. Altri aspetti non trascurabili sono il relativo basso costo e la semplicità della configurazione chirurgica.
Vale la pena ricordare che i modelli di ischemia-reperfusione del miocardio possono presentare risultati diversi rispetto ai modelli MI permanenti. Processi biologici come il tipo di morte cellulare impegnata, qualità/ampiezza o cinetica delle risposte infiammatorie e di guarigione delle ferite nel tessuto miocardico possono variare a seconda del modello5,6,7. Tuttavia, questo protocollo di occlusione coronarica permanente può essere facilmente adattato per ottenere un modello di ischemia-reperfusione.
Questo metodo è rilevante per gli studi relativi alla fisiopatologia dell’MI senza riperfusione e consente il monitoraggio dei processi patologici che si verificano dall’occlusione coronarica (minuti) all’insufficienza cardiaca in fase avanzata (settimane) presso il tessuto cardiaco locale e Livelli.
La prima fase critica di questa procedura è certamente l’intubazione. Usiamo l’ago interno smussato di un catetere 16 G come tubo tracheale. Si sconsiglia di utilizzare questa configurazione con topi che pesano meno di 22 g. Con questa configurazione, può essere difficile intubare i topi correttamente con peso corporeo più piccolo senza danneggiare la trachea. Un altro punto critico è quello di limitare le incisioni fatte al muscolo mentre espongono la trachea e la gabbia toracica. Ridurre il danno ai tessuti è di grande importanza, soprattutto quando si studiano i processi infiammatori successivi a MI. Ecco perché preferiamo la delicata diffusione del muscolo e delle costole con pinze e retrattili8,9. Non usiamo cauterizzatore elettrico per controllare il sanguinamento10. Questo può causare ustioni iatrogeniche e favorire le infezioni. Sia i traumi che le infezioni possono disperdere le letture infiammatorie. L’applicazione di un PEEP estrinseca di 3 cm H2O facendo immergere lo scarico di ventilazione in un tubo dell’acqua limita il collasso dell’alveolare end-expiratory durante la toracotomia. La localizzazione di LAD è un altro passo critico e si dovrebbe tenere a mente che l’anatomia delle arterie coronarie può variare a seconda del ceppo e il genotipo del topo11. Richiede una certa esperienza per visualizzare il LAD, tuttavia posizionando la sutura direttamente 2-3 mm sotto gli atri a sinistra come descritto nella procedura deve consentire il corretto posizionamento della legatura. Lo scolorimento istantaneo di grandi porzioni del ventricolo sinistro sotto la sutura conferma la precisione. Infine, l’applicazione artificiale di auto-PEEP bloccando lo scarico di ventilazione per 2-3 cicli respiratori durante la chiusura toracica consente un’iperinflazione transitoria del polmone che aiuterà a inseguire l’aria dalla cavità toracica12. Non eseguiamo intenzionalmente una toracentesi come mostrato in 9,10. In questo modo, limitiamo il rischio di lesioni polmonari e cardiache ed evitiamo danni eccessivi ai tessuti o perforazioni.
La miocardia-reperfusione (I/R) è un modello chirurgico correlato che imita il ripristino del flusso sanguigno coronarica che viene fatto ai pazienti miti nelle cliniche. Durante il modello I/R viene eseguita un’occlusione transitoria dell’arteria coronaria stringendo un pezzo di tubo sul LAD per una durata di 20-45 min8,13. Quindi l’occlusione viene rilasciata per consentire la riperfusione del miocardio per la durata desiderata. Questa semplice modifica applicata al nostro protocollo può facilmente trasformarla in un modello I/R4,8,14,15. L’infarto può essere confermato da un esame del sangue per troponina cardiaca T8,10 o da ecocardiografia15.
MI si differenzia dal modello I/R perché la riperfusione di per sé induce un infortunio. MI induce più necrosi tissutale e apoptosi è più pronunciata nel miocardio reperfuso5. Cinetica delle cellule infiammatorie infiltrazione è anche diverso tra in MI e IR con un’infiltrazione miocardiale ritardata delle cellule immunitarie in MI7. Le dimensioni e la posizione dell’area infarto differiranno anche tra i modelli di ligazione permanente e i modelli I/R15. Tenendo questo in mente, bisogna essere cauti di scegliere un modello rilevante dal momento che i modelli I/R e MI permanente non sono equivalenti. Un altro modello murino dell’infarto miocardico è il modello crioinfarinia. L’applicazione di una sonda criogenica sulla parete anteriore LV induce il congelamento del tessuto ventricolare e l’arresto del flusso sanguigno nell’arteria LAD. Questa tecnica tuttavia differisce dalle tecniche MI e I/R per quanto riguarda la tempistica e l’ampiezza di rimodellamento e risposte infiammatorie16,17.
La variabilità è una limitazione come per qualsiasi procedura chirurgica. Questa variabilità si basa sulle differenze biologiche. Un buon esempio è la variazione nella disposizione coronarica arteriosa nei topi11. Si basa anche sulle abilità degli sperimentatori. Vale la pena ricordare che un’adeguata formazione degli sperimentatori è obbligatoria per raggiungere risultati stabili con questo modello. Uno sperimentatore ben addestrato può facilmente produrre dimensioni infarto che sono riproducibili (Figura 3A-B). La mortalità del modello dipende dalla posizione del LAD, dalla durata degli esperimenti (giorni, settimane), dalla deformazione del topo e dai genotipi. I tipi di farmaci anestetici e analgesici possono anche influenzare l’esito degli esperimenti con effetti cardioprotettivi o cardiodepressivi. Nelle nostre mani, questo modello ha un tasso di mortalità globale del 25-30%. Questo tasso di mortalità comprende morti e sacrifici spontanei prima della fine dell’esperimento, indipendentemente dai ceppi e dalla durata dell’esperimento. La maggior parte dei decessi o sacrifici sono tra il secondo e il quarto giorno dopo l’intervento chirurgico. L’applicazione di una rigorosa gestione del dolore e il follow-up degli animali può ridurre la mortalità.
Qui presentiamo risultati rappresentativi della dimensione infarto analizzati utilizzando la colorazione E’cdi ttC e l’espressione di proteine e geni coinvolti nei processi infiammatori o fibroti in LV da macchia occidentale e PCR in tempo reale rispettivamente (Figura 3C-G). È anche possibile misurare molti di questi parametri mediante saggi immunosorbena enzimatici (ELISA) o saggi enzimatici. Naturalmente, secondo ipotesi che deve essere testata, questo metodo può essere seguito da qualsiasi analisi funzionale da ultrasuoni, risonanza magnetica o misurazione catetere intraventricolare di pressione e volume. È anche possibile estrarre il cuore e studiare ulteriormente la biologia delle cellule cardiache su cellule isolate. Nel complesso, il modello MI con legatura permanente dell’arteria coronaria LAD è particolarmente utile per valutare i processi infiammatori e fibrotici, la guarigione delle ferite e i cambiamenti nella funzione cardiaca dopo l’infarto miocardico.
The authors have nothing to disclose.
Questo modello è stato sviluppato con il supporto della Fondazione nazionale svizzera per la scienza (Concede 310030_162629 a LL) e dei fondi dipartimentali provenienti dai servizi di Chirurgia Toracica e Medicina Intensiva dell’Ospedale Universitario di Losanna. JL è insignito di una sovvenzione dalla Fondazione Emma Muschamp. Riconosciamo il supporto cruciale dei veterinari e del personale addetto alle strutture animali della Facoltà di Biologia e Medicina dell’Università di Losanna. Ringraziamo la Dott.ssa Giuseppina Milano del Servizio di Chirurgia Cardiaca dell’Ospedale Universitario di Losanna e il Dr. Alexandre Sarre dell’Università di Losanna per i loro suggerimenti tecnici.
1 CC Syringe, Omnifix-F | B. Braun | 9161406V | |
30G- Needle | BD Microlance 3 | 304000 | |
70% Ethanol | |||
Betadine 60 ml | MundiPharma | ||
Blunt Retractors | Fine Science Tools | 18200-09 | |
Castroviejo Needle Holder Straight with Lock | Roboz | RS-6416 | |
Cotton Swabs | Applimed SA | 6001109 | |
Dissecting Scissors, Curved | Aesculap | BC603R | |
Electrical Razor | Remington | HC720 | |
Glucose 5% B.Braun | B. Braun | 531032 | |
Hair Removal Cream, Veet | Silk & Fresh Tech. | 8218535 | |
Iris Dissecting Forceps Full Curved | Aesculap | OC022R | |
Ketasol 100 (100 mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN01AX03 | |
Micro Scissors, Curved Blunt/Blunt | Aesculap | FM013R | |
NaCl 0.9% B. Braun | B. Braun | 534534 | |
Short Fixator | Fine Science Tools | 18200-01 | |
Silk Suture 5-0, BB | Ethicon | K880H | |
Silk Suture 6-0, P-1 | Ethicon | 639H | |
Silk Suture 7-0,BV-1 | Ethicon | K804 | |
Student Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | |
Student Fine Forceps-Angled | Fine Science Tools | 91110-10 | |
Surgical Gloves | Weitacare | 834301 | |
Surgical heating pad | Personalized setting | ||
Temgesic sol 0.3 mg/ml Buprenorphine | Indivior Schweiz AG | N02AE01 | |
Tracheal tube inner needle of an 16G i.v. cat | Abbocath-T | G714-A01 | |
Universal S3 Microscope, OMPIMD | Zeizz | ||
Ventilator, MiniVent Model 845 | Harvard Apparatus | 73-0043 | |
Viscotears | Alcon | 1551535 | |
Xylasol (1mg/ml) | Dr. E. Graeub AG | QN05CM92 |