这种方法描述了一种慢性制剂,允许光学访问活小鼠的海马区。这种制剂可用于在几周内对神经元结构可塑性和活动诱发细胞可塑性进行纵向光学成像。
双光子显微镜是神经科学的基本工具,因为它允许在从亚细胞到网络水平的空间尺度上对活体动物的大脑进行调查,在从毫秒到周的时间尺度上。此外,双光子成像可以结合各种行为任务来探索大脑功能和行为之间的因果关系。然而,在哺乳动物中,有限的穿透力和散射光限制了两光子的在生命内成像,主要局限于浅层大脑区域,从而排除了对深脑区域(如海马区)的纵向调查。海马参与空间导航和偶发性记忆,是一个长期模型,用于研究细胞和认知过程,对学习和回忆都非常重要,无论是在健康和疾病。在这里,详细介绍了一种准备,使活小鼠的背海马的慢性光学访问。这种制备物可以结合双光子光学成像在细胞和亚细胞分辨率在头部固定,麻醉活小鼠在几个星期。这些技术使神经元结构或活动引起的可塑性在背海马CA1的数以十到数百个神经元的重复成像。此外,这种慢性制备可与其他技术结合使用,如显微内窥镜、头装广域显微镜或三光子显微镜,从而大大扩展了工具箱,以研究所涉及的细胞和网络过程在学习和记忆。
在哺乳动物中,海马是编码和回忆偶发性记忆以及空间导航1、2、3、4的关键大脑区域。出于这个原因,海马已经-现在仍然是-一个非常重要的模型,研究基本机制,使大脑编码和回忆记忆5,6,7或在一个环境中导航8 ,9收集奖励和避免危险。此外,海马形成是大脑区域之一,在啮齿动物10、11和人类12、13的一生中产生新的神经元。最后,海马形成的退化或损伤与神经和精神疾病有关,包括阿尔茨海默氏病14。
在小鼠中,海马位于大脑表面15以下约1毫米处。它的位置阻止了完整大脑的光学访问,因此,海马动力学的纵向研究主要依靠磁共振成像、电生理学和前体成像分析。MR成像方法允许跟踪生物过程(例如,基因表达变化16)在同一动物多天,但缺乏空间分辨率,以区分单个神经元。经典的体内电生理技术提供非常高的时间分辨率和对膜电位变化的精细敏感性。然而,它们的空间分辨率有限,并且缺乏在较长时间段内可靠地跟踪相同细胞的能力。光学成像允许以其较高的时间和空间分辨率来研究更多样化的过程。然而,前体成像只提供正在进行的过程的快照,因此它不适合在动物学习和回忆信息的纵向研究。
体内光学成像将MR成像和电生理学的一些优点与光学成像的优点相结合。因此,它非常适合对小鼠大脑动力学和行为进行纵向和相关的分析。这与生物过程的研究有关,其速度非常快(毫秒到秒)或非常慢(天到周)的时间尺度。与神经科学相关的这些过程的例子包括膜电压动力学、Ca2+瞬变、细胞可塑性和结构变化,这些都被认为对记忆形成和回忆非常重要。不同的方法已经扩展到体内成像到背海马18,19,20,21,22。急性制剂已经允许跟踪金字塔神经元(PN)活动,以及他们的树突和树突脊柱几个小时20,22。然而,这一时间框架不允许研究长期结构变化,而这种变化可能是渐进式学习的基础。慢性制剂 – 结合微内窥镜23,24或长工作距离 (WD) 标准显微镜目标21 – 已使背海马的重复成像在几个星期。
在这里,我们描述了一种慢性制剂,它使用永久插入的成像导管,提供对活体小鼠背海马的CA1子场的反复光学访问。这种制备允许反复访问CA1,不受功能干扰,适用于生命内双光子(2P)或广域显光成像。详细介绍了活体小鼠背毛CA1中2P深脑慢性成像的两个例子:树突状结构和树突状脊柱动力学的纵向成像和活动可塑性的纵向成像。讨论了该技术的显著优点和局限性。
这里描述了在活小鼠中重复2P成像的手术过程。手术后,小鼠通常在2天内恢复。手术诱导最小的天体化26,43。手术后可能出现的出血和水肿通常在10至14天内重新吸附。一般来说,从植入后14天起,准备足够清晰,可以进行生命内成像。手术的成功并不取决于在无菌环境中工作。然而,保持高水平的卫生,以避免因手术相关感染引起的并发症,这一点至关重要。这是通过精心清洁手术器械之前和之后的手术器械,并通过热消毒他们立即每次使用(步骤2.1.1)获得。在植入前,将光管放入一个清洁的消毒容器中,然后用无菌盐水冲洗。对外科站进行手部消毒和清洁的常见手术实践也非常重要。制剂保持稳定,并允许细胞和亚细胞分辨率成像几个星期26,35。
关键步骤、修改和故障排除。
在最深的纤维暴露之前,剥离外部胶囊非常重要。当使用具有 3 或 4 mm WD 的商业目标时,不暴露白化可能导致无法聚焦于 PN 的体体,或降低分辨率成像树突状脊柱。为此,使用直径为 0.9 mm 的针非常缓慢地将新皮质切除非常有用,然后切换到直径为 0.3-0.5 mm(24-29 度)的针头,在去除最背纤维时,对吸力进行更精细的控制。或者,细钳可用于去除纤维暴露后的剩余皮层36。
手术期间出血可能会有问题,因为血液会阻碍视线。建议等待血块形成,然后用盐水冲洗以洗去残留的血液。根据需要重复。
在套管和颅骨切除术之间贴合有助于提高制备的稳定性,在使用水泥之前保持管紧到位,特别是如果管状的外缘与头骨齐平。由于三甲钻和管状的大小是匹配的,因此由于管状侧面的不规则性(需要稍大颅骨来适应(参见步骤 2.3.14)或不规则颅切除术,可能会出现松动的配合。必须关闭任何管状不规则(步骤 1.3 和 1.12),并且颅骨必须垂直于颅骨,直到颅骨切除术完成(步骤 2.3.12)。在完成颅骨切除术之前,从颅骨中取出颅骨可能导致不规则的颅骨。
限制-制备的侵入性和稳定性。
很难评估皮质消融的影响,因为要精确定义直接和间接受影响的区域是很困难的。一般来说,手术去除了部分皮层和部分视觉和后肢感觉皮层21。腹肌皮层不直接投射到海马,海马组织既没有接触也没有受伤。重要的是,已经表明,植入成像管不会严重改变海马功能,特别是海马依赖学习21,36,37,38, 39.不过,通过评估皮质酮血水平和肾上腺重量与植入物相比,定量到何种程度的管状和植入物的外部部分(头支架板和牙科丙烯酸帽)是慢性压力源,这一点很重要。未植入的小鼠。
准备工作一般保持稳定,从数周到数月26日。从长远来看,皮肤和骨骼生长往往会取代丙烯酸盖,并增加成像制剂的不稳定性。
光学限制。
传统的2P显微镜允许成像约1毫米深到新皮质组织40,41。与此一致,可以对位于 SR(图2D-F) 或 SLM36中的树突和树突状脊柱进行成像。然而,通过导管成像对有效NA有限制。为了实现最大分辨率,成像管的直径和深度应与成像 NA 相匹配,因为直径更小、深度较长会夹住高 NA 物镜的光线。例如,当通过 1.6 mm 长的导管对 1.0 NA 水浸镜进行成像时,需要 3.65 mm 的内径来保持完整的 NA。然而,使用这种直径的导管会增加海马的压缩,并可能影响组织的健康,因此,我们使用直径较小的导管。当通过 1.6 mm 长的管状使用 0.8 NA 水浸物进行成像时,2.5 mm 的内径足以保持完整的 NA。但是,0.8 NA 水浸物目标具有较短的 WD(在我们的案例中为 3 mm),这可以防止对 SP 进行聚焦。
这些计算适用于管底视野的中心。然而,将成像视场侧向移动 – 靠近管状边缘 – 或更深入地聚焦到组织 – 远离管状的玻璃表面 – 会进一步降低焦平面处的有效 NA,从而降低分辨率。这将导致不同体积的图像组织产生非均质分辨率,并可能是亚细胞分辨率定量成像的一个关注点,尤其是在使用超分辨率技术(如2P-STED显微镜42)时。当以蜂窝分辨率成像时,这些问题就不那么重要了。
组织运动。
组织内的运动 – 源自麻醉动物的呼吸和心跳 – 往往变得更加严重,与成像管断的距离增加。这可能是因为成像管状对大脑施加机械压力,从而抵消在导管附近的一些运动(类似于新皮质制剂)。因此,虽然在 SR 和 SLM 中可以成像树突状脊柱,但在我们手中,它是从管状表面到 SO 最坚固的背向高达 200 μm。为了补偿运动,我们使用共振扫描仪和离线平均。以最大可用速度(30 帧/秒)获取 z 堆栈每个图像平面的多个图像(4 到 6 次重复)。然后,每个 z 平面的所有重复都进行去解(使用商业软件 AutoQuant),注册(使用 ImageJ),并平均到单个图像26中。对于索马塔的成像,运动在麻醉35时通常可以忽略不计,两个平均值通常足以补偿运动伪影。
方法的未来应用或方向.
制备可与微内窥镜26、43结合。微内窥镜是刚性光学探头,使用梯度折射率(GRIN)微透镜来引导光线从深组织18。使用微型内窥镜允许直径较小的管状,甚至根本没有管状。然而,商业微内窥镜对光学畸变的校正程度较低,并且比商业目标具有更低的NA。电流探头达到 ±0.6-1 μm、±10-12 μm 的横向和轴向分辨率,分别为17、18、44 。微内窥镜的使用也使这种制备与头戴式集成宽场显微镜45,46,47的组合。
该方法也可用于非麻醉小鼠,并已用于研究细胞活动使用Ca2+传感器在清醒的头固定小鼠21,37,48,49。在这些情况下,由于荧光变化的时间尺度很快,建议实施线路注册50。也可以调整其他海马亚区域的成像准备,如登酸陀螺(DG)39,51,52。结合这种制备与3P激发53,54与1MHz频率脉冲激光调谐到1400nm,我们能够成像更深的海马形成到达分子层,颗粒细胞层和DG 的 hilus (图 4) 而不移除覆盖 CA1。
总之,我们提出了一种方法,提供光学访问背海马,并允许纵向和相关的研究海马结构和活动的动态。该技术扩展了在生理和病理条件下分析海马功能的可能性。
The authors have nothing to disclose.
美国基金会得到施拉姆基金会的支持;C.-W.T.P.和W.G.得到马克斯·普朗克协会的支持;L.Y. 和 R.Y. 由马克斯·普朗克协会和国家卫生研究所 (R01MH080047, 1DP1NS096787) 提供支持;A. C. 得到欧洲研究理事会、欧洲网络网和I-CORE项目、以色列卫生部首席科学家办公室、联邦教育和研究部、罗伯托和雷纳塔·鲁曼、布鲁诺和西蒙娜·利奇的FP7赠款的支持。内拉和莱昂·贝诺齐约神经疾病中心、亨利·查诺克·克伦特生物医学成像和基因组学研究所、以色列科学基金会珀尔曼家族、阿德利斯、马克·贝森、普拉特和欧文·莫斯科维茨基金会;A. A. 得到马克斯·普朗克协会、施拉姆基金会和德意志基金会的支持。3P 图像是在马克斯·普朗克佛罗里达神经科学研究所神经成像技术高级课程期间获得的。神经成像技术高级课程由马克斯·普朗克协会、佛罗里达州马克斯·普朗克科学奖学金计划以及马克斯·普朗克佛罗里达研究所合作计划支持。我们要感谢Thorlabs、相干和光谱物理学在课程期间为2P/3P成像系统提供支持和设备。我们也感谢亨利·海伯勒和梅丽莎·埃伯勒在课程期间为系统提供协助。
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Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
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Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
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Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
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Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
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Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |