Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.
Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein grundlegendes Werkzeug für die Neurowissenschaften, da sie die Untersuchung des Gehirns lebender Tiere in räumlichen Maßstäben von subzellulären bis zu Netzwerkebenen und in zeitlichen Skalen von Millisekunden bis Wochen ermöglicht. Darüber hinaus kann die Zwei-Photonen-Bildgebung mit einer Vielzahl von Verhaltensaufgaben kombiniert werden, um die kausalen Zusammenhänge zwischen Gehirnfunktion und Verhalten zu untersuchen. Bei Säugetieren haben jedoch die begrenzte Penetration und Streuung von Licht die intravitale Zwei-Photon-Bildgebung hauptsächlich auf oberflächliche Hirnregionen beschränkt und damit eine Längsuntersuchung von Tiefhirnbereichen wie dem Hippocampus ausgeschlossen. Der Hippocampus ist an der räumlichen Navigation und dem episodischen Gedächtnis beteiligt und ist ein langjähriges Modell, das verwendet wird, um zelluläre sowie kognitive Prozesse zu studieren, die für das Lernen und Erinnern wichtig sind, sowohl bei Gesundheit als auch bei Krankheiten. Hier wird ein Präparat detailliert beschrieben, das einen chronischen optischen Zugang zum dorsalen Hippocampus bei lebenden Mäusen ermöglicht. Dieses Präparat kann mit einer zweiphotonenoptischen Bildgebung bei zellulärer und subzellulärer Auflösung in Kopf fixierten, anästhesierten lebenden Mäusen über mehrere Wochen kombiniert werden. Diese Techniken ermöglichen eine wiederholte Bildgebung der neuronalen Struktur oder aktivitätsevokten Plastizität in Dutzenden bis Hunderten von Neuronen im dorsalen Hippocampus CA1. Darüber hinaus kann diese chronische Präparation in Kombination mit anderen Techniken wie Mikroendoskopie, kopfmontierter Weitfeldmikroskopie oder Drei-Photonen-Mikroskopie eingesetzt werden, wodurch die Toolbox zur Untersuchung von Zell- und Netzwerkprozessen erheblich erweitert wird. in Lernen und Gedächtnis.
Bei Säugetieren ist der Hippocampus eine wichtige Hirnregion für die Kodierung und den Rückruf episodischer Erinnerungen sowie für die räumliche Navigation1,2,3,4. Aus diesem Grund war und ist der Hippocampus ein sehr wichtiges Modell, um die grundlegenden Mechanismenzu studieren, die es dem Gehirn ermöglichen, Erinnerungen 5,6,7 zu kodieren und zurückzurufen oder in einer Umgebung zu navigieren8 ,9 Belohnungen sammeln und Gefahren vermeiden. Darüber hinaus ist die Hippocampus-Bildung eine der Hirnregionen, in denen neue Neuronen während des gesamten Lebens der Nagetiere10,11 und möglicherweise des Menschen12,13erzeugt werden. Schließlich sind Degeneration oder Beeinträchtigung der Hippocampusbildung mit neurologischen und psychiatrischen Störungen verbunden, einschließlich der Alzheimer-Krankheit14.
Bei Mäusen befindet sich der Hippocampus etwa 1 mm unter der Hirnoberfläche15. Seine Position hat den optischen Zugang im intakten Gehirn verhindert, und folglich stützten sich Längsstudien der Hippocampusdynamik hauptsächlich auf Magnetresonanzgebungs-, Elektrophysiologie- und Ex-vivo-Bildgebungsanalysen. MR-Bildgebungsmethoden ermöglichen die Verfolgung biologischer Prozesse (z. B. Genexpressionsänderungen16) bei demselben Tier über mehrere Tage, aber es fehlt die räumliche Auflösung, um einzelne Neuronen zu unterscheiden. Klassische elektrophysiologische In-vivo-Techniken bieten eine sehr hohe zeitliche Auflösung und eine exquisite Empfindlichkeit gegenüber Veränderungen des Membranpotenzials. Sie haben jedoch eine begrenzte räumliche Auflösung und es fehlt ihnen an der Fähigkeit, dieselben Zellen über längere Zeiträume zuverlässig zu verfolgen. Die optische Bildgebung ermöglicht die Erforschung unterschiedlicher Prozesse aufgrund ihrer hohen zeitlichen und räumlichen Auflösungen. Ex-vivo-Bildgebung liefert jedoch nur Momentaufnahmen laufender Prozesse und ist daher nicht für Längsstudien geeignet, bei denen die Tiere Informationen lernen und abrufen.
Die optische Bildgebung in vivo kombiniert einige Vorteile der MR-Bildgebung und Elektrophysiologie mit denen der optischen Bildgebung. Daher ist es sehr gut geeignet für Längs- und Korrelativanalysen der Maus-Gehirndynamik und -verhalten. Dies ist relevant in Studien von biologischen Prozessen mit sehr schnellen (Millisekunden bis Sekunden) oder sehr langsamen (Tagen bis Wochen) Zeitskalen. Beispiele für solche prozesse, die für die Neurowissenschaft relevant sind, sind Membranspannungsdynamik, Ca 2+-Transienten, zelluläre Plastizität und strukturelle Veränderungen, die alle als sehr wichtig für die Gedächtnisbildung und den Rückruf angesehen werden. Verschiedene Methoden haben in vivo Bildgebung auf den dorsalen Hippocampus18,19,20,21,22erweitert. Akute Präparate haben die Verfolgung der pyramidenförmigen Neuron (PN) Aktivität sowie deren Dendriten und dendritischen Stacheln für mehrere Stundenerlaubt 20,22. Dieser zeitliche Zeitrahmen erlaubt es jedoch nicht, langfristige strukturelle Veränderungen zu untersuchen, die dem inkrementellen Lernen zugrunde liegen könnten. Chronische Präparate – in Kombination mit Mikroendoskopen23,24 oder mit langen Arbeitswegen (WD) Standardmikroskopobjektive21 – haben eine wiederholte Bildgebung des dorsalen Hippocampus über mehrere Wochen.
Hier beschreiben wir ein chronisches Präparat, das einen wiederkehrenden optischen Zugang zum CA1-Unterfeld des dorsalen Hippocampus lebender Mäuse mit einer dauerhaft eingefügten bildgebenden Kanüle ermöglicht. Dieses Präparat ermöglicht den wiederholten Zugriff auf die CA1 ohne Funktionsstörungen und eignet sich für intravitale Zweiphotonen (2P) oder Weitfeld-Epifluoreszenz-Bildgebung. Zwei Beispiele für die chronische 2P-Bildgebung im tiefen Gehirn in der dorsalen CA1 von lebenden Mäusen sind detailliert: Längsbildgebung der dendritischen Struktur und dendritische Wirbelsäulendynamik und Längsbildgebung der aktivitätsevozierten Plastizität. Die wesentlichen Vorteile und Grenzen der Technik werden diskutiert.
Hier wird ein Verfahren zur wiederholten 2P-Bildgebung der dorsalen CA1 bei lebenden Mäusen beschrieben. Nach der Operation erholt sich die Maus in der Regel innerhalb von 2 Tagen. Das Verfahren induziert minimale Astrogliose26,43. Blutungen und Ödeme, die auf die Operation folgen könnten, werden in der Regel innerhalb von 10 bis 14 Tagen erneut adsorbiert. In der Regel ist das Präparat ab 14 Tagen nach der Implantation ausreichend klar, um eine intravitale Bildgebung durchzuführen. Der Erfolg der Operation hängt nicht von der Arbeit in einer sterilen Umgebung ab. Es ist jedoch entscheidend, ein hohes Maß an Hygiene aufrechtzuerhalten, um Komplikationen aufgrund von chirurgisch-assoziierten Infektionen zu vermeiden. Dies wird durch eine sorgfältige Reinigung der chirurgischen Instrumente vor und nach der Operation und durch Wärmesterilisation unmittelbar vor jeder Anwendung (Schritt 2.1.1) erreicht. Die optische Kanüle wird in einem sauberen, sterilisierten Behälter aufbewahrt und kurz vor der Implantation mit steriler Saline abgeführt. Die Durchführung gängiger chirurgischer Praxen der Händedesinfektion und Reinigung der chirurgischen Station ist ebenfalls sehr wichtig. Das Präparat bleibt stabil und ermöglicht eine zelluläre und subzelluläre Auflösung simperge Für mehrere Wochen26,35.
Kritische Schritte, Änderungen und Fehlerbehebung.
Es ist wichtig, die äußere Kapsel zu schälen, bis die tiefsten Fasern freigelegt sind. Wenn der Alveus nicht entlarven wird, kann dies dazu führen, dass er sich nicht auf den Soma von PNs konzentrieren kann, oder in einer reduzierten Auflösung, die dendritische Stacheln abbilden, wenn kommerzielle Ziele mit 3- oder 4-mm-WD verwendet werden. Zu diesem Zweck ist es sinnvoll, den Neocortex sehr langsam mit einer Nadel mit 0,9 mm Durchmesser abzustreifen und dann auf eine 0,3-0,5 mm Durchmessernadel (24-29 Gauge) umzuschalten, um eine feinere Kontrolle der Absaugung beim Entfernen der dorsalsten Fasern zu erhalten. Alternativ können feine Zangen verwendet werden, um den verbleibenden Kortex nach der Faserexposition36zu entfernen.
Blutungen während der Operation können problematisch sein, da Blut die Sicht versperrt. Es wird empfohlen, auf die Bildung des Gerinnsels zu warten und dann mit Derinline zu spülen, um Restblut wegzuwaschen. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.
Eine enge Passform zwischen kanülen und der Kraniotomie trägt dazu bei, die Stabilität der Zubereitung zu erhöhen, indem die Kanüle vor dem Auftragen des Zements an Ort und Stelle gehalten wird, besonders wenn der äußere Rand der Kanüle mit dem Schädel bündig ist. Da die Größen des Trephinbohrers und der Kanüle aufeinander abgestimmt sind, kann eine lockere Passform aufgrund von Unregelmäßigkeiten an der Kanüle – die etwas größere Craniotomien erfordern (siehe Schritt 2.3.14) – oder einer unregelmäßigen Kraniotomie entstehen. Alle Kanülenunregelmäßigkeiten müssen abgelegt werden (Schritte 1.3 und 1.12) und das Trephin muss senkrecht zum Schädel gehalten werden, bis die Kraniotomie abgeschlossen ist (Schritt 2.3.12). Das Entfernen des Trephins aus dem Schädel, bevor die Kraniotomie abgeschlossen ist, kann zu unregelmäßigen Craniotomien führen.
Einschränkungen- Invasivität und Stabilität des Präparats.
Es ist schwierig, die Wirkung der kortikalen Ablation zu bewerten, da es mühsam ist, die betroffenen Gebiete direkt und indirekt genau zu definieren. Im Allgemeinen entfernt die Operation einen Teil des parietalen Kortex und einen Teil des visuellen und hinteren Sinnesrinds21. Der ablated Kortex projiziert nicht direkt auf den Hippocampus und Hippocampusgewebe wird weder berührt noch verletzt. Wichtig ist, dass die Implantation einer bildgebenden Kanüle die Hippocampusfunktion und insbesondere das hippocampalabhängige Lernennichtgrob verändert. 39. Dennoch wäre es wichtig zu quantifizieren, inwieweit sowohl die Kanüle als auch der äußere Teil des Implantats (Kopfhalterplatte und Zahnacrylkappe) chronische Stressoren sind, indem man die Corticosteron-Blutspiegel und das Nebennierengewicht im Vergleich zu unimplantierte Mäuse.
Die Zubereitung bleibt in der Regel von Wochen bis Monaten stabil26. Langfristig neigen Haut- und Knochenwachstum dazu, die Acrylkappe zu verdrängen und die Instabilität der bildgebenden Zubereitung zu erhöhen.
Optische Einschränkungen.
Herkömmliche 2P-Mikroskopie ermöglicht die Bildgebung bis zu etwa 1 mm tief in neokortikales Gewebe40,41. In Übereinstimmung damit ist es möglich, Dendriten und dendritische Stacheln im SR (Abbildung 2D-F) oder SLM36abzubilden. Die Bildgebung durch eine Kanüle stellt jedoch Einschränkungen für die effektive NA dar. Um die maximale Auflösung zu erreichen, sollten Durchmesser und Tiefe der bildgebenden Kanülen auf die bildgebende NA abgestimmt werden, da kleinere Durchmesser und längere Tiefen das Licht von hohen NA-Objektiven abschneiden. Bei der Bildgebung mit einem 1,0 NA-Wassertauchobjektiv durch eine 1,6 mm lange Kanüle wird beispielsweise ein Innendurchmesser von 3,65 mm benötigt, um die volle NA zu halten. Jedoch, mit einer Kanüle dieses Durchmessers wird die Kompression auf dem Hippocampus erhöhen und könnte die Gesundheit des Gewebes beeinflussen, aus diesem Grund verwenden wir eine Kanüle mit einem kleineren Durchmesser. Bei der Bildgebung mit einem Wassertauchobjektiv von 0,8 NA durch eine 1,6 mm lange Kanüle würde ein Innendurchmesser von 2,5 mm ausreichen, um die volle NA zu halten. Allerdings haben 0,8 NA-Wassertauchziele eine kürzere WD (3 mm in unserem Fall), die verhindern kann, dass sie sich auf den SP konzentrieren.
Diese Berechnungen gelten für die Mitte des Sichtfeldes am unteren Rand der Kanüle. Das seitliche Verschieben des bildgebenden Sichtfeldes – näher an den Rändern der Kanüle – oder die tiefere Fokussierung in das Gewebe – weiter von der Glasoberfläche der Kanüle entfernt – verringert jedoch die effektive NA an der Brennebene weiter und reduziert so die Auflösung. Dies führt zu einer nicht homogenen Auflösung über die verschiedenen Volumina des abgebildeten Gewebes hinweg und kann ein Problem für die quantitative Bildgebung bei subzellulärer Auflösung sein, insbesondere bei der Verwendung von Super-Resolution-Techniken wie der 2P-STED-Mikroskopie42. Diese Probleme sind weniger wichtig, wenn es um die Bildgebung bei zellulärer Auflösung geht.
Gewebebewegung.
Die Bewegung im Gewebe – die von Atmung und Herzschlag bei anästhesierten Tieren herrühren – neigt dazu, mit zunehmender Entfernung von der bildgebenden Kanüle schwerer zu werden. Dies liegt möglicherweise daran, dass die bildgebende Kanüle mechanischen Druck auf das Gehirn ausübt und somit einen Teil der Bewegung in der Nähe der Kanüle entgegenwirkt (ähnlich wie neokortikale Präparate). Obwohl die Abbildung von dendritischen Stacheln in SR und SLM in unseren Händen möglich ist, ist sie in unseren Händen am robustesten dorsal bis zur SO bis zu 200 m von der Oberfläche der Kanüle entfernt. Um Die Bewegung zu kompensieren, verwenden wir Resonanzscanner und Offline-Mittelung. Mehrere Bilder (4 bis 6 Wiederholungen) werden pro Bildebene eines Z-Stacks mit der maximal verfügbaren Geschwindigkeit (30 Frames/s) aufgenommen. Alle Wiederholungen für jede Z-Ebene werden dann dekonvolved (mit der kommerziellen Software, AutoQuant), registriert (mit ImageJ) und gemittelt in einem einzigen Bild26. Für die Abbildung von Somata ist die Bewegung bei Anästhesie oft vernachlässigbar35 und zwei Durchschnitte reichen oft aus, um Bewegungsartefakte zu kompensieren.
Zukünftige Anwendungen oder Anweisungen der Methode .
Die Zubereitung kann mit Mikroendoskopen26,43kombiniert werden. Mikroendoskope sind starre optische Sonden, die Gradienten-Refractive Index (GRIN)-Mikrolinsen verwenden, um Licht zu und von tiefem Gewebe zu leiten18. Die Verwendung von Mikroendoskopen ermöglicht Kanülen mit kleineren Durchmessern oder gar keine Kanülen. Kommerzielle Mikroendoskope sind jedoch weniger gut für optische Aberrationen korrigiert und haben niedrigere NA als kommerzielle Ziele. Die Stromsonden erreichen seitliche und axiale Auflösungen von 0,6-1 m, 10-12 m bzw.17,18,44. Der Einsatz von Mikroendoskopen ermöglicht auch die Kombination dieser Zubereitung mit kopfmontierten integrierten Weitfeldmikroskopen45,46,47.
Die Methode eignet sich auch in nicht-anästhesierten Mäusen zu verwenden, und es wurde verwendet, um zelluläre Aktivität mit Ca2+ Sensoren in wachen Kopf-fixierten Mäusen21,37,48,49zu untersuchen. In diesen Fällen ist es aufgrund der schnellen Zeitskalen der Fluoreszenzänderungen ratsam, die Zeilenregistrierung50zu implementieren. Es ist auch möglich, die Vorbereitung für die Bildgebung anderer Hippocampus-Unterregionen wie den tate gyrus (DG)39,51,52anzupassen. Durch die Kombination dieses Präparats mit 3P Anregung53,54 mit 1 MHz Frequenz pulsiertlaser auf 1400 nm abgestimmt, waren wir in der Lage, tiefer in die Hippocampus-Formation zu bilden, die die molekulare Schicht, Granulat-Zell-Schicht und die der GD (Abbildung 4), ohne die überlagernde CA1 zu entfernen.
Zusammenfassend stellen wir eine Methode vor, die einen optischen Zugang zum dorsalen Hippocampus ermöglicht und längs- und korrelative Untersuchungen der Dynamik der Hippocampusstruktur und -aktivität ermöglicht. Diese Technik erweitert die Möglichkeiten der Analyse der Hippocampusfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.
The authors have nothing to disclose.
U. A. F. wird von der Schram-Stiftung unterstützt; C.-W. T. P. und W. G. werden von der Max-Planck-Gesellschaft unterstützt; L.Y. und R.Y. werden von der Max-Planck-Gesellschaft und dem National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787) unterstützt; A. C. wird unterstützt durch einen RP7-Zuschuss des Europäischen Forschungsrats, der Programme ERANET und I-CORE, des Chief Scientist Office des israelischen Gesundheitsministeriums, des Bundesministeriums für Bildung und Forschung, Roberto und Renata Ruhman, Bruno und Simone Lich, Nella und Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, das Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, The Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt und Irving I. Moskowitz stiftung; A. A. wird von der Max-Planck-Gesellschaft, der Schram-Stiftung und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) unterstützt. Die 3P-Bilder wurden während des Advanced Course on Neuroimaging Techniques am Max-Planck-Florida-Institut für Neurowissenschaften aufgenommen. Der Advanced Course on Neuroimaging Techniques wird von der Max-Planck-Gesellschaft, dem Florida State Max-Planck Scientific Fellowship-Programm und dem Max-Planck-Institut unterstützt. Wir danken Thorlabs, Coherent und SpectraPhysics für die Unterstützung und Ausrüstung für das 2P / 3P Bildgebungssystem während des Kurses. Wir danken auch Henry Haeberle und Melissa Eberle für die Unterstützung des Systems während des Kurses.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
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Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
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Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
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Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
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Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
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Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
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Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
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Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
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Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
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Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
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Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
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Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
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RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |