Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.
La microscopía de dos fotones es una herramienta fundamental para la neurociencia, ya que permite la investigación del cerebro de animales vivos a escalas espaciales que van desde los niveles subcelulares a los niveles de red y a escalas temporales de milisegundos a semanas. Además, las imágenes de dos fotones se pueden combinar con una variedad de tareas conductuales para explorar las relaciones causales entre la función cerebral y el comportamiento. Sin embargo, en los mamíferos, la penetración limitada y la dispersión de la luz han limitado las imágenes intravitales de dos fotones principalmente a las regiones cerebrales superficiales, lo que excluye la investigación longitudinal de áreas del cerebro profundo como el hipocampo. El hipocampo participa en la navegación espacial y la memoria episódica y es un modelo de larga data utilizado para estudiar procesos celulares y cognitivos importantes para el aprendizaje y la memoria, tanto en salud como en enfermedades. Aquí, se detalla una preparación que permite el acceso óptico crónico al hipocampo dorsal en ratones vivos. Esta preparación se puede combinar con imágenes ópticas de dos fotones a resolución celular y subcelular en ratones vivos fijos y anestesiados durante varias semanas. Estas técnicas permiten tomar imágenes repetidas de la estructura neuronal o la plasticidad evocada por la actividad en decenas a cientos de neuronas en el hipocampo dorsal CA1. Además, esta preparación crónica se puede utilizar en combinación con otras técnicas como la microendoscopia, la microscopía de campo ancho montada en la cabeza o la microscopía de tres fotones, ampliando así en gran medida la caja de herramientas para estudiar los procesos celulares y de red involucrados en el aprendizaje y la memoria.
En los mamíferos, el hipocampo es una región cerebral clave para la codificación y recuperación de recuerdos episódicos, así como para la navegación espacial1,2,3,4. Por esta razón, el hipocampo ha sido -y sigue siendo- un modelo muy importante para estudiar los mecanismos básicos que permiten al cerebro codificar y recordar recuerdos5,6,7 o navegar en un entorno8 ,9 recogiendo recompensas y evitando peligros. Además, la formación del hipocampo es una de las regiones cerebrales donde se generan nuevas neuronas a lo largo de la vida de los roedores10,11 y, posiblemente, de los seres humanos12,13. Finalmente, la degeneración o deterioro de la formación del hipocampo se asocian con trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer14.
En ratones, el hipocampo se encuentra aproximadamente 1 mm por debajo de la superficie cerebral15. Su posición ha impedido el acceso óptico en el cerebro intacto y, en consecuencia, los estudios longitudinales de la dinámica del hipocampo se han basado principalmente en imágenes de resonancia magnética (RM), electrofisiología y análisis de imágenes ex vivos. Los métodos de diagnóstico por rmn permiten el seguimiento de los procesos biológicos (por ejemplo, cambios en la expresión génica16) en el mismo animal durante varios días, pero carecen de la resolución espacial para discriminar las neuronas individuales. Las técnicas electrofisiológicas clásicas in vivo ofrecen una resolución temporal muy alta y una sensibilidad exquisita a los cambios en el potencial de la membrana. Sin embargo, tienen una resolución espacial limitada y carecen de la capacidad de rastrear de forma fiable las mismas celdas durante períodos de tiempo más largos. Las imágenes ópticas permiten estudiar procesos más diversos en virtud de sus altas resoluciones temporales y espaciales. Sin embargo, las imágenes ex vivo sólo proporcionan instantáneas de los procesos en curso, por lo que no es adecuada para estudios longitudinales durante los cuales los animales aprenden y recuerdan información.
La imagen óptica in vivo combina algunas ventajas de la imagen por RMN y la electrofisiología con las de las imágenes ópticas. Por lo tanto, es muy adecuado para análisis longitudinales y correlativos de la dinámica y el comportamiento del cerebro del ratón. Esto es relevante en estudios de procesos biológicos con escalas de tiempo muy rápidas (milisegundos a segundos) o muy lentas (días a semanas). Ejemplos de tales procesos que son relevantes para la neurociencia son la dinámica de voltaje de membrana, Ca2+ transitorios, plasticidad celular y cambios estructurales, que se cree que son muy importantes para la formación de la memoria y la memoria. Diferentes métodos han extendido la imagen in vivo al hipocampo dorsal18,19,20,21,22. Las preparaciones agudas han permitido el seguimiento de la actividad de la neurona piramidal (PN), así como sus dendritas y espinas dendríticas durante varias horas20,22. Este marco temporal, sin embargo, no permite estudiar los cambios estructurales a largo plazo, que podrían subyacen al aprendizaje incremental. Las preparaciones crónicas – en combinación con microendoscopios23,24 o con objetivos estándar de microscopio de larga distancia de trabajo (WD)21 – han permitido la toma repetida de imágenes del hipocampo dorsal en varios Semanas.
Aquí, describimos una preparación crónica que proporciona acceso óptico recurrente al subcampo CA1 del hipocampo dorsal de ratones vivos utilizando una cánula de imagen insertada permanentemente. Esta preparación permite el acceso repetido al CA1 sin perturbaciones funcionales y es adecuada para imágenes intravitales de dos fotones (2P) o epifluorescencia de campo ancho. Se detallan dos ejemplos de imágenes crónicas del cerebro profundo 2P en la CA1 dorsal de ratones vivos: imágenes longitudinales de la estructura dendrítica y dinámica delatrítica de la columna vertebral e imágenes longitudinales de plasticidad evocada por la actividad. Se discuten las ventajas y limitaciones más destacadas de la técnica.
Aquí, se describe un procedimiento para imágenes 2P repetidas del CA1 dorsal en ratones vivos. Después de la cirugía, el ratón generalmente se recupera dentro de 2 días. El procedimiento induce astrogliosis mínima26,43. La hemorragia y el edema que podrían seguir la cirugía generalmente se reabsorben dentro de 10 a 14 días. Generalmente, a partir de los 14 días después de la implantación, la preparación es lo suficientemente clara como para realizar imágenes intravitales. El éxito de la cirugía no depende de trabajar en un ambiente estéril. Sin embargo, es crucial mantener un alto nivel de higiene, para evitar complicaciones debido a infecciones asociadas a la cirugía. Esto se obtiene limpiando meticulosamente los instrumentos quirúrgicos antes y después de la cirugía y esterilizando con calor inmediatamente antes de cada uso (paso 2.1.1). La cánula óptica se mantiene en un recipiente limpio y esterilizado y se enjuaga con solución salina estéril justo antes de la implantación. La realización de prácticas quirúrgicas comunes de desinfección de manos y limpieza de la estación quirúrgica también es muy importante. La preparación se mantiene estable y permite la toma de imágenes de resolución celular y subcelular durante varias semanas26,35.
Pasos críticos, modificaciones y solución de problemas.
Es importante pelar la cápsula externa hasta que las fibras más profundas estén expuestas. Si no se expone el alveus, la incapacidad de centrarse en el soma de los PN, o en espinas dendríticas por imágenes de resolución reducida, cuando se utilizan objetivos comerciales con WD de 3 o 4 mm. Para ello, es útil ablar el neocórtex muy lentamente usando una aguja de 0,9 mm de diámetro y luego cambiar a una aguja de 0,3-0,5 mm de diámetro (calibre 24-29) para un control más fino de la succión al retirar la mayoría de las fibras dorsales. Alternativamente, los fórceps finos se pueden utilizar para eliminar la corteza restante después de la exposición a la fibra36.
El sangrado durante la cirugía puede ser problemático, ya que la sangre obstruye la vista. Se recomienda esperar a que se forme el coágulo y luego encerrarse con salina para lavar la sangre residual. Repita según sea necesario.
Un ajuste ceñido entre la cánula y la craneotomía ayuda a aumentar la estabilidad de la preparación manteniendo la cánula en su lugar antes de la aplicación del cemento, especialmente si el borde exterior de la cánula está al ras con el cráneo. Dado que los tamaños del taladro trephine y la cánula están emparejados, puede surgir un ajuste suelto debido a irregularidades en el lado de la cánula – que requieren craneotomías ligeramente más grandes para caber (ver paso 2.3.14) – o de una craneotomía irregular. Cualquier irregularidad de cánula debe ser archivada (pasos 1.3 y 1.12) y la trefina debe mantenerse perpendicular al cráneo hasta que se complete la craneotomía (paso 2.3.12). La eliminación de la trephina del cráneo antes de que se complete la craneotomía puede dar lugar a craneotomias irregulares.
Limitaciones- Invasividad y estabilidad de la preparación.
Es difícil evaluar el efecto de la ablación cortical, ya que es arduo definir con precisión las zonas afectadas directa e indirectamente. En general, la cirugía extirpa parte de la corteza parietal y parte de la corteza sensorial visual y de las extremidades posteriores21. La corteza ablada no se proyecta directamente al hipocampo y el tejido del hipocampo no se toca ni se lesiona. Es importante destacar que se ha demostrado que la implantación de una cánula de imagen no altera gravemente la función del hipocampo y específicamente el aprendizaje dependiente del hipocampo21,36,37,38, 39. Aún así, sería importante cuantificar en qué medida tanto la cánula como la parte externa del implante (placa de soporte de cabeza y tapa de acrílico dental) son estresores crónicos mediante la evaluación de los niveles de la sangre de corticosterona y el peso de la glándula suprarrenal en comparación con ratones no implantados.
La preparación generalmente se mantiene estable de semanas a meses26. A largo plazo, el crecimiento de la piel y los huesos tiende a desplazar la tapa de acrílico y a aumentar la inestabilidad de la preparación por imágenes.
Limitaciones ópticas.
La microscopía 2P convencional permite tomar imágenes de hasta 1 mm de profundidad en el tejido neocortical40,41. De acuerdo con esto, es posible tomar imágenes dendritas y espinas dendríticas ubicadas en el SR (Figura 2D-F) o SLM36. Sin embargo, la toma de imágenes a través de una cánula presenta limitaciones a la NA efectiva. Para lograr la máxima resolución, el diámetro y la profundidad de las cánulas de imagen deben coincidir con la nA de imagen, ya que los diámetros más pequeños y las profundidades más largas recortarán la luz de los objetivos de nA altos. Por ejemplo, cuando se toma imágenes con un objetivo de inmersión en agua de 1,0 NA a través de una cánula de 1,6 mm de largo, se necesita un diámetro interior de 3,65 mm para mantener el NA completo. Sin embargo, el uso de una cánula de este diámetro aumentará la compresión en el hipocampo y podría afectar a la salud del tejido, por esta razón, utilizamos una cánula con un diámetro más pequeño. Cuando se toma imágenes con un objetivo de inmersión en agua de 0,8 NA a través de una cánula de 1,6 mm de largo, un diámetro interior de 2,5 mm sería suficiente para mantener el NA completo. Sin embargo, los objetivos de inmersión en agua de 0,8 NA tienen un WD más corto (3 mm en nuestro caso), lo que puede evitar que se enfoque en el SP.
Estos cálculos se aplican al centro del campo de visión en la parte inferior de la cánula. Sin embargo, mover el campo de visión de imágenes de lado – más cerca de los bordes de la cánula – o enfocar más profundamente en el tejido – más lejos de la superficie de vidrio de la cánula – disminuye aún más el NA efectivo en el plano focal y, por lo tanto, reduce la resolución. Esto conducirá a una resolución no homogénea en los diferentes volúmenes de tejido con imágenes y puede ser una preocupación por las imágenes cuantitativas a resolución subcelular, especialmente cuando se utilizan técnicas de superresolución como la microscopía 2P-STED42. Estos problemas son menos importantes cuando se toma imágenes a la resolución celular.
Movimiento de tejido.
El movimiento dentro del tejido, que se origina en la respiración y los latidos del corazón en animales anestesiados, tiende a ser más grave con una mayor distancia desde la cánula de imágenes. Esto es posiblemente porque la cánula de imagen aplica presión mecánica al cerebro, lo que contrarresta parte del movimiento en las proximidades de la cánula (de forma similar a las preparaciones neocorticales). Por lo tanto, aunque la toma de imágenes de espinas dendríticas es posible en SR y SLM, en nuestras manos, es más robusto dorsal a la SO hasta 200 m de la superficie de la cánula. Para compensar el movimiento, utilizamos escáneres resonantes y promediación fuera de línea. Se adquieren varias imágenes (de 4 a 6 repeticiones) por plano de imagen de una pila z a la velocidad máxima disponible (30 fotogramas/s). Todas las repeticiones para cada plano z se desconvolved (utilizando el software comercial, AutoQuant), registrado (usando ImageJ) y promediado en una sola imagen26. Para las imágenes de somata, el movimiento a menudo es insignificante con la anestesia35 y dos promedios a menudo son suficientes para compensar los artefactos de movimiento.
Futuras aplicaciones o direcciones del método .
La preparación se puede combinar con microendoscopios26,43. Los microendoscopios son sondas ópticas rígidas que utilizan microlentes de índice de refracción de gradiente (GRIN) para guiar la luz hacia y desde el tejido profundo18. El uso de microendoscopios permite cánulas de diámetros más pequeños o incluso no cánulas en absoluto. Sin embargo, los microendoscopios comerciales están menos bien corregidos para las aberraciones ópticas y tienen nA más bajo que los objetivos comerciales. Las sondas de corriente alcanzan resoluciones laterales y axiales de 0,6-1 m, 10-12 m, respectivamente17,18,44. El uso de microendoscopios también permite la combinación de esta preparación con microscopios de campo ancho integrados montados en la cabeza45,46,47.
El método se presta también para su uso en ratones no anestesiados, y se ha utilizado para investigar la actividad celular utilizando sensores Ca2+ en ratones fijos en la cabeza despiertos21,37,48,49. En estos casos, debido a las rápidas escalas de tiempo de los cambios de fluorescencia, es aconsejable implementar el registro de línea50. También es posible adaptar la preparación para la toma de imágenes de otras subregiones hipocampales como el gyrus dentate (DG)39,51,52. Combinando esta preparación con la excitación 3P53,54 con 1 MHz frecuencia pulsada láser sintonizado a 1400 nm, pudimos imagen más profunda en la formación del hipocampo llegando a la capa molecular, capa de células gránulo y la capa de células del gránulo y la hilus de la DG (Figura 4) sin quitar la superposición CA1.
En conclusión, presentamos un método que proporciona acceso óptico al hipocampo dorsal y permite estudios longitudinales y correlativos de la dinámica de la estructura y actividad del hipocampo. Esta técnica amplía las posibilidades de análisis de la función del hipocampo en condiciones fisiológicas y patológicas.
The authors have nothing to disclose.
U. A. F. cuenta con el apoyo de la Fundación Schram; C.-W. T. P. y W. G. cuentan con el apoyo de la Sociedad Max Planck; L.Y. y R.Y. cuentan con el apoyo de la Sociedad Max Planck y el Instituto Nacional de Salud (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. cuenta con el apoyo de una beca del 7PM del Consejo Europeo de Investigación, los programas ERANET e I-CORE, la Oficina Principal de Científicos del Ministerio de Salud de Israel, el Ministerio Federal de Educación e Investigación, Roberto y Renata Ruhman, Bruno y Simone Lich, Nella y Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, el Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, The Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt and Irving I. Moskowitz foundations; A. A. cuenta con el apoyo de la Max Planck Society, la Fundación Schram y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Las imágenes 3P fueron adquiridas durante el Curso Avanzado de Técnicas de Neuroimagen en el Instituto Max Planck Florida de Neurociencia. El Curso Avanzado sobre Técnicas de Neuroimagen es apoyado por la Sociedad Max Planck, el programa de Becas Científicas Max Planck del Estado de Florida y el programa de Asociación de La Corporación del Instituto Max Planck Florida. Nos gustaría agradecer a Thorlabs, Coherent y SpectraPhysics por proporcionar soporte y equipo para el sistema de imágenes 2P / 3P durante el curso. También estamos agradecidos a Henry Haeberle y Melissa Eberle por la ayuda con el sistema durante el curso.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |