Denna metod beskriver en kronisk beredning som tillåter optisk tillgång till Hippocampus levande möss. Denna beredning kan användas för att utföra longitudinell optisk avbildning av neuronala strukturella plasticitet och aktivitet-framkallat cellulär plasticitet under en period av flera veckor.
Två-Photon mikroskopi är ett grundläggande verktyg för neurovetenskap eftersom det tillåter undersökning av hjärnan hos levande djur på rumsliga skalor allt från subcellulära till nätverksnivåer och vid tidsmässiga skalor från millisekunder till veckor. Dessutom kan två-Photon Imaging kombineras med en mängd olika beteendemässiga uppgifter för att utforska orsakssambanden mellan hjärnans funktion och beteende. Men hos däggdjur, begränsad penetration och spridning av ljus har begränsad två-Photon intravital avbildning mestadels till ytliga hjärnregioner, vilket utesluter longitudinell undersökning av djupa hjärnområden såsom hippocampus. Hippocampus är involverad i spatial navigering och episodiskt minne och är en långvarig modell som används för att studera cellulära samt kognitiva processer viktiga för inlärning och återkallande, både i hälsa och sjukdom. Här, en beredning som möjliggör kronisk optisk tillgång till dorsala Hippocampus i levande möss är detaljerad. Denna beredning kan kombineras med två-Photon optisk avbildning på cellulära och subcellulära upplösning i huvudet fast, sövda levande möss under flera veckor. Dessa tekniker möjliggör upprepad avbildning av neuronala struktur eller aktivitet-framkallat plasticitet i tiotals till hundratals nervceller i dorsala Hippocampus CA1. Dessutom kan detta kroniska preparat användas i kombination med andra tekniker såsom mikro-endoskopi, Head-monterad wide fält mikroskopi eller tre-Photon mikroskopi, vilket kraftigt expanderande verktygslådan för att studera cellulära och nätverk processer inblandade i inlärning och minne.
Hos däggdjur, Hippocampus är en viktig hjärnregion för kodning och återkallande av episodiska minnen samt för rumslig navigering1,2,3,4. Av denna anledning har Hippocampus varit-och fortfarande är-en mycket viktig modell för att studera de grundläggande mekanismer som gör det möjligt för hjärnan att koda och återkalla minnen5,6,7 eller att navigera i en miljö8 ,9 samla belöningar och undvika faror. Dessutom är den Hippocampus formation en av de hjärnregioner där nya nervceller genereras under hela livet av gnagare10,11 och, möjligen, av människor12,13. Slutligen, degeneration eller försämring av hippocampus bildandet är förknippade med neurologiska och psykiska störningar, inklusive Alzheimers sjukdom14.
I möss, Hippocampus ligger cirka 1 mm under hjärn ytan15. Dess position har förhindrat optisk åtkomst i intakt hjärna och följaktligen, longitudinella studier av hippocampus dynamik har åberopats främst på magnetisk resonans (MR) Imaging, elektrofysiologi, och ex vivo Imaging analyser. MR Imaging metoder tillåter spårning av biologiska processer (t. ex., genuttryck förändringar16) i samma djur under flera dagar, men saknar den rumsliga upplösningen att diskriminera enstaka nervceller. Klassisk in vivo elektrofysiologiska tekniker erbjuder mycket hög temporala upplösning och utsökt känslighet för förändringar i membranet potential. De har dock en begränsad rumslig upplösning och de saknar förmågan att på ett tillförlitligt sätt spåra samma celler över längre tidsperioder. Optisk avbildning gör att mer varierande processer kan studeras på grund av dess höga temporala och rumsliga upplösningar. Ex vivo Imaging ger dock endast ögonblicksbilder av pågående processer, och därför är det inte lämpligt för longitudinella studier under vilka djuren lär sig och minns information.
In vivo optisk avbildning kombinerar vissa fördelar med MR Imaging och elektrofysiologi med de av optisk avbildning. Därför är det mycket väl lämpad för longitudinella och korrelativa analyser av mus hjärnans dynamik och beteende. Detta är relevant i studier av biologiska processer med mycket snabb (millisekunder till sekunder) eller mycket långsamma (dagar till veckor) tidsskalor. Exempel på sådana processer som är relevanta för neurovetenskap är membranspänningsdynamik, ca2 + transienter, cellulär plasticitet och strukturella förändringar, som alla tros vara mycket viktiga för minnesbildning och återkallande. Olika metoder har förlängt in vivo avbildning till dorsala Hippocampus18,19,20,21,22. Akuta preparat har gjort det möjligt att spåra pyramidala neuron (PN) aktivitet samt deras dendriter och dendritiska Taggar i flera timmar20,22. Denna tidsmässiga tidsram medger dock inte långsiktiga strukturella förändringar, som kan ligga till grund för stegvis inlärning, som skall studeras. Kroniska preparat-i kombination med mikro-endoskop23,24 eller med långa arbetsavstånd (WD) standard Mikroskop mål21 -har möjliggjort upprepad avbildning av dorsala Hippocampus över flera Veckor.
Här beskriver vi en kronisk beredning som ger återkommande optisk tillgång till CA1 sub-området i dorsala Hippocampus levande möss med en permanent insatt Imaging kanyl. Denna beredning möjliggör upprepad tillgång till CA1 utan funktionella störningar och är lämplig för intravital två-Photon (2P) eller wide-fält epifluorescens Imaging. Två exempel på 2P djupa hjärnan kronisk avbildning i dorsala CA1 av levande möss är detaljerade: longitudinell avbildning av dendritiska struktur och dendritiska ryggraden dynamik och longitudinell avbildning av aktivitet-framkallat plasticitet. Den salient fördelar och begränsningar av tekniken diskuteras.
Här beskrivs ett förfarande för upprepad 2P avbildning av dorsala CA1 i levande möss. Efter operationen, musen återhämtar sig vanligtvis inom 2 dagar. Förfarandet inducerar minimal astrogliosis26,43. Blödning och ödem som kan följa operationen är oftast omadsorberas inom 10 till 14 dagar. Generellt, från 14 dagar efter implantationen och framåt är preparatet tillräckligt klart för att utföra intravital avbildning. Framgången för operationen är inte beroende av att arbeta i en steril miljö. Emellertid, det är viktigt att upprätthålla en hög nivå av hygien, för att undvika komplikationer på grund av kirurgi-associerade infektioner. Detta erhålls genom minutiöst rengöring av kirurgiska instrument före och efter operationen och genom att värma sterilisera dem omedelbart före varje användning (steg 2.1.1). Den optiska kanyl hålls i en ren, steriliserad behållare och sköljas med steril saltlösning strax före implantation. Att utföra vanliga kirurgiska ingrepp i händer desinfektion och rengöring av Operations stationen är också mycket viktigt. Preparatet förblir stabilt och tillåter cellulära och subcellulära upplösning Imaging för flera veckor26,35.
Kritiska steg, modifieringar och felsökning.
Det är viktigt att skala den externa kapseln tills de djupaste fibrerna exponeras. Underlåtenhet att exponera alveus kan resultera i oförmåga att fokusera på Soma av PNS, eller i minskad upplösning Imaging dendritiska taggar, när du använder kommersiella mål med 3-eller 4-mm WD. För detta ändamål är det lämpligt att ablera neocortex mycket långsamt med en 0,9 mm diameter nål och sedan byta till en 0,3-0,5 mm diameter (24-29 gauge) nål för en finare kontroll av sug när du tar bort de mest rygg fibrer. Alternativt kan fina pinps användas för att ta bort kvarvarande cortex efter fiber exponering36.
Blödning under operationen kan vara problematiskt, som blod blockerar vyn. Väntar på koagel att bilda och sedan skölja med saltlösning för att tvätta bort restblod rekommenderas. Upprepa vid behov.
En Snug passar mellan kanyl och kraniotomi hjälper till att öka stabiliteten i preparatet genom att hålla kanyl på plats innan applicering av cement, särskilt om den yttre kanten av kanyl är i jämnhöjd med skallen. Eftersom storleken på trefin borr och kanyl matchas, kan en lös passform uppstå på grund av oegentligheter på sidan av kanyl-som kräver något större kraniotomier att passa (se steg 2.3.14)-eller från en oregelbunden kraniotomi. Eventuella avvikelser från kanyl måste lämnas in (steg 1,3 och 1,12) och trefin måste hållas vinkelrät mot skallen tills kraniotomi har slutförts (steg 2.3.12). Ta bort trefin från skallen innan kraniotomi är klar kan resultera i oregelbundna kraniotomier.
Begränsningar- Av preparatets invasivitet och stabilitet.
Det är svårt att utvärdera effekten av kortikal ablation eftersom det är mödosamt att exakt definiera de områden som påverkas direkt och indirekt. I allmänhet tar operationen bort en del av parietala cortex och en del av den visuella och bakbenet sensoriska cortex21. Den avlägsnas cortex inte direkt projekt till hippocampus och Hippocampus vävnad är varken rörd eller skadad. Viktigt, det har visats att implantation av en avbildning kanyl inte grovt Alter Hippocampus funktion och specifikt Hippocampus-beroende inlärning21,36,37,38, 39. Ändå skulle det vara viktigt att kvantifiera i vilken utsträckning både kanyl och den externa delen av implantatet (huvud hållare plattan och Dental akryl mössa) är kroniska stressorer genom att bedöma kortikosteron blodnivåer och binjurar vikt i jämförelse med unimplanterade möss.
Preparatet är i allmänhet stabilt från veckor till månader26. På lång sikt, hud och bentillväxt tenderar att tränga undan akryl locket och att öka instabiliteten i Imaging preparatet.
Optiska begränsningar.
Konventionell 2p-mikroskopi möjliggör avbildning upp till ca 1 mm djupt in i neokortikala vävnaden40,41. I överensstämmelse med detta är det möjligt att avbilda dendriter och dendritiska taggar som finns i SR (figur 2D-F) eller SLM36. Imaging genom en kanyl innebär dock begränsningar för den effektiva NA. För att uppnå maximal upplösning, bör diametern och djupet av Imaging kanyler matchas mot Imaging na, eftersom mindre diametrar och längre djup kommer att klämma ljus av höga na-mål. Till exempel, när avbildning med en 1,0 NA vatten nedsänkning mål genom en 1,6 mm lång kanyl, en 3,65 mm innerdiameter behövs för att hålla hela NA. Men med hjälp av en kanyl av denna diameter kommer att öka kompressionen på Hippocampus och kan påverka hälsan hos vävnaden, av denna anledning använder vi en kanyl med en mindre diameter. Vid avbildning med en 0,8 NA vatten nedsänkning mål genom en 1,6 mm lång kanyl, en innerdiameter på 2,5 mm skulle räcka för att hålla hela NA. Men, 0,8 NA vatten nedsänkning mål har en kortare WD (3 mm i vårt fall), som kan hindra från att fokusera på SP.
Dessa beräkningar gäller centrum av synfältet längst ner på kanylen. Men flytta Imaging synfält sidewise-närmare kanterna på kanyl-eller fokusera djupare in i vävnaden-längre från glasytan av kanyl-ytterligare minskar den effektiva NA vid fokalplanet och därmed minskar upplösningen. Detta kommer att leda till icke-homogen upplösning över de olika volymerna av avbildade vävnad och kan vara ett bekymmer för kvantitativ avbildning vid subcellulära upplösning, särskilt när man använder super-resolution tekniker som 2p-sted mikroskopi42. Dessa problem är mindre viktiga vid avbildning vid mobil upplösning.
Vävnad rörelse.
Rörelse inom vävnaden-kommer från andning och hjärtslag i sövda djur-tenderar att bli mer allvarliga med ökat avstånd från Imaging kanyl. Detta är möjligen på grund av att Imaging kanyl applicerar mekaniskt tryck till hjärnan vilket motverkar en del av rörelsen i närheten av kanyl (på samma sätt som neokortikala preparat). Således, även om avbildning av dendritiska taggar är möjligt i SR och SLM, i våra händer, är det mest robust rygg till så upp till ≈ 200 μm från ytan av kanyl. För att kompensera för rörelse, använder vi resonant skannrar och offline averaging. Flera bilder (4 till 6 repetitioner) förvärvas per bild plan av en z-stack vid maximal tillgänglig hastighet (30 bildrutor/s). Alla repetitioner för varje z-Plane är sedan deconvolved (med hjälp av kommersiell programvara, AutoQuant), registrerade (med ImageJ) och i genomsnitt i en enda bild26. För avbildning av Somata, är rörelse ofta försumbar vid anestesi35 och två medelvärden är ofta tillräckliga för att kompensera för rörelse artefakter.
Framtida applikationer eller riktningar av metoden .
Preparatet kan kombineras med mikroendoskop26,43. Micro-endoskop är stela optiska sonder som använder gradient brytningsindex (grin) mikrolinser för att vägleda ljus till och från djup vävnad18. Användningen av mikro-endoskop tillåter kanyl av mindre diametrar eller till och med ingen kanyl alls. Kommersiella mikroendoskop korrigeras dock mindre väl för optiska avvikelser och har lägre NA än kommersiella mål. Aktuella sonder når laterala och axiella upplösningar på ≈ 0,6-1 μm, ≈ 10-12 μm, respektive17,18,44. Användningen av mikroendoskop möjliggör också kombinationen av denna beredning med huvudmonterade integrerade widefield Mikroskop45,46,47.
Metoden lämpar sig också att använda i icke-sövda möss, och det har använts för att undersöka cellulära aktivitet med ca2 + sensorer i vaken Head-fast möss21,37,48,49. I dessa fall, på grund av de snabba tidsskalor av fluorescens förändringar, är det tillrådligt att genomföra linje registrering50. Det är också möjligt att anpassa förberedelserna för avbildning av andra underregioner i hippocampus, såsom dentate gyrus (DG)39,51,52. Kombinera denna beredning med 3P excitation53,54 med 1 MHz frekvens pulsad laser trimmad till 1400 nm, vi kunde bilden djupare in i hippocampus bildandet når molekyl skiktet, granule cellskikt och hilus av DG (figur 4) utan att ta bort överliggande CA1.
Sammanfattningsvis presenterar vi en metod som ger optisk tillgång till dorsala hippocampus och möjliggör longitudinella och korrelala studier av dynamiken i hippocampus struktur och aktivitet. Denna teknik utökar möjligheterna till analys av hippocampus funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd.
The authors have nothing to disclose.
U. A. F. stöds av Schram Foundation; C.-W. T. P. och W. G. stöds av Max Planck Society; L.Y. och liitto stöds av Max Planck Society och National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. stöds av ett FP7 bidrag från Europeiska forskningsrådet, ERANET och I-CORE program, Chief Scientist Office av det israeliska hälsoministeriet, det federala ministeriet för utbildning och forskning, Roberto och Renata Ruhman, Bruno och Simone Lich, The Nella och Leon Benoziyo centrum för neurologiska sjukdomar, Henry Chanoch Krenter Institutet för biomedicinsk avbildning och genomik, Israel Science Foundation den Perlman familjen, Adelis, Marc Besen, Pratt och Irving I. Moskowitz stiftelser; A. A. stöds av Max Planck Society, Schram Foundation och Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). 3P-bilderna förvärvades under den avancerade kursen om neuroimaging tekniker vid Max Planck-institutet för neurovetenskap. Den avancerade kursen om neuroimaging tekniker stöds av Max Planck Society, Florida State Max Planck Scientific Fellowship program och av Max Planck-institutet Corporation partnerskapsprogram. Vi vill tacka Thorlabs, sammanhängande och SpectraPhysics för att ge stöd och utrustning för 2P/3P Imaging system under kursen. Vi är också tacksamma mot Henry Haeberle och Melissa Eberle för hjälp med systemet under kursens gång.
Professional drill/grinder IBS/E | Proxxon GmbH | 28481 | Pecision drill |
MICROMOT drill stand MB 200 | Proxxon GmbH | 28600 | Movable ruler table |
MICRO compound table KT 70 | Proxxon GmbH | 27100 | Movable ruler table |
Machine vice MS 4 | Proxxon GmbH | 28132 | Movable ruler table |
Stainless steel tube Ø 3,0 x 0,25 mm (Inner Ø 2,5 mm ) L = 500 mm | Sawade | R00303 | Stainless steel tube for the cannula metal ring |
Microscope Cover glass (4 mm round) | Engelbrecht Medizin and Labortechnik | Glass coverslips for the cannula glass | |
Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui | Hoffmann Group | 713750 160 | Manual files |
Präzisions-Nadelfeile Gesamtlänge 140 mm 4 | Hoffmann Group | 527230 4 | Manual files |
UV-Curing Optical Adhesives | Thorlabs | NOA81 | UV-curing adhesive |
UV Curing LED System, 365 nm | Thorlabs | CS2010 | UV-curing LED driver unit |
Stemi 305 | Zeiss | Stereoscope | |
Presto II | NSK-Nakanishi Germany | Z307015 | Dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein | MF Dental | F837.014.FG | Files for the dental drill |
Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob | MF Dental | G837.014.FG | Files for the dental drill |
Graefe Forceps – Straight / Serrated | Fine Science Tools | 11050-10 | Forceps for the surgery |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-05 | 0.5 mm width burr for the micro-drill |
Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19008-09 | 0.9 mm width burr for the micro-drill |
MicroMotor mit Handstück | DentaTec | MM11 | Micro-drill for the craniotomy |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | Dumont forceps for the surgery |
Fine Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | Scissors for the surgery |
Trephine | MW Dental | 229-020 | Trephine drill – 3.0 mm diameter; for the micro-drill |
Stainless Steel Self-Tapping Bone Screws | Fine Science Tools | 19010-10 | 0.86 mm width bone screws |
Stereotaxic apparatus | Kopf | Stereotaxic apparatus | |
3-D-Gelenkarm | Hoffmann Group | 442114 | Stereotaxic arm and plate holder |
Aufnahme 2SM | Hoffmann Group | 442100 2SM | Stereotaxic arm and plate holder |
Hot Bead Sterilizers | Fine Science Tools | 18000-45 | Glass beads sterilizer |
Isofluran CP, Flasche 250 ml | Henry Schein VET GmbH | 798932 | Liquid isoflurane for anesthesia |
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer | Harvard Apparatus GmbH | 34-1040 | Isoflurane vaporizer |
Lab Active Scavenger | Gropper Medizintechnik | UV17014 | Isoflurane scavenger system |
Metacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml | Henry Schein VET GmbH | 798566 | Meloxicam, anti-inflammatory |
Vetalgin 500 mg/ml | MSD Tiergesundheit | Vetalgin, pain killer | |
CMA 450 Temperature Controller | Hugo Sachs Elektronik – Harvard Apparatus GmbH | 8003770 | Heating blanket |
Bepanthen Augen- und Nasensalbe | Bayer AG | Ophtalmic ointment | |
KL 1500 LCD | Schott | Fiber optic light source | |
Xylocain Pumpspray | AstraZeneca GmbH | Lidocain, local anesthetic | |
Absorption Triangles – Unmounted | Fine Science Tools | 18105-03 | Absorption triangles for the surgery |
Parkell C&B Metabond clear powder L | Hofmeester dental | 013622 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Quick Base B | Hofmeester dental | 013621 | Quick adhesive cement |
Parkell C&B Metabond Universal Catalyst C | Hofmeester dental | 013620 | Quick adhesive cement |
Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | Precision applicators for the surgery |
Blunt needles 0.9×23 mm | Dentina | 0441324 | Blunt needles |
Blunt needles 0.5×42 mm | Dentina | 0452155 | Blunt needles |
Blunt needles 0.3×23 mm | Dentina | 0553532 | Blunt needles |
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | Acrylic liquid component |
Kallocryl | Speiko | 1609 | Acrylic powder |
Hydrofilm transparent roll | Hartmann | Adhesive film | |
Head plates | Custom made | 30 mm x 10 mm size; 8 mm diameter hole, titanium | |
Head plate clamp | Custom made | Head plate holder | |
Pedestal post holders | Thorlabs | PH20E/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR30/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR75/M | Head plate holder |
Stainless steel post | Thorlabs | TR150/M | Head plate holder |
Post connector clamps | Custom made | Head plate holder | |
Aluminum Breadboard, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps | Thorlabs | MB3045/M | Microscope stage |
7" x 4" Lab Jack | Thorlabs | L490/M | Microscope stage |
Low profile face mask small mice | Emka Technologies | VetFlo-0801 | Anesthesia facemask holder |
RS4000 Tuned Damped Top Performance Optical Table | Newport | Floating table | |
S-2000A Top Performance Pneumatic Vibration Isolators with Automatic Re-Leveling | Newport | Floating table | |
Power Meter Model 1918-R | Newport | Power meter | |
X-Cite 120Q | Excelitas Technologies | Fluorescence lamp | |
Two-photon microscope | Bruker | Ultima IV | Two-photon microscopes |
Two-photon microscope | Thorlabs | Bergamo | Two-photon microscopes |
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22 | Olympus | Objectives | |
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5 | Olympus | Objectives | |
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18 | Olympus | Objectives | |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | Mai Tai Deep See | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 2P excitation | Spectraphysics | InSight DS+ Dual beam | Excitaiton lasers |
Ultafast tunable laser for 3P excitation | Coherent | Monaco | Excitaiton lasers |