Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase
Summary
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) peut enzymatiquement enlever l’oxygène diatomique libre d’un système aqueux utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA). Ce protocole décrit l’expression, la purification, et l’analyse d’activité de cette enzyme de récupération d’oxygène.
Abstract
La microscopie à molécule unique (SM) est utilisée dans l’étude des interactions moléculaires dynamiques des biomolécules étiquetées fluorophore en temps réel. Cependant, les fluorophores sont sujets à la perte de signal par photoblanchiment par l’oxygène dissous (O2). Pour prévenir le photoblanchiment et prolonger la durée de vie du fluorophore, des systèmes de récupération d’oxygène (OSS) sont utilisés pour réduire L’O2. Les OSS disponibles dans le commerce peuvent être contaminés par des nucléases qui endommagent ou dégradent les acides nucléiques, ce qui confond l’interprétation des résultats expérimentaux. Ici nous détaillons un protocole pour l’expression et la purification du protocatechuate fortement actif de Pseudomonas de Pseudomonas-3,4-dioxygenase (PCD) sans contamination détectable de nucléane. Le PCD peut éliminer efficacement les espèces réactives O2 en reconversion de l’acide protocatechuic substrat (PCA) en acide 3-carboxy-cis,cis-muconic. Cette méthode peut être utilisée dans n’importe quel système aqueux où O2 joue un rôle préjudiciable dans l’acquisition de données. Cette méthode est efficace dans la production de PCD très actif et sans nucléane par rapport au PCD disponible dans le commerce.
Introduction
La biophysique à molécule unique (SM) est un domaine en croissance rapide qui change notre façon de voir les phénomènes biologiques. Ce domaine a la capacité unique de lier les lois fondamentales de la physique et de la chimie à la biologie. La microscopie de fluorescence est une méthode biophysique qui peut atteindre la sensibilité SM. La fluorescence est utilisée pour détecter les biomolécules en les reliant à de petits fluorophores organiques ou à des points quantiques1. Ces molécules peuvent émettre des photons lorsqu’elles sont excitées par des lasers avant de photobleaching irréversiblement2. Photobleaching se produit lorsque les étiquettes fluorescentes subissent des dommages chimiques qui détruit leur capacité à exciter à la longueur d’onde désirée2,3. La présence d’espèces réactives d’oxygène (ROS) dans le tampon aqueux sont une cause primaire de photoblanchiment2,4. En outre, ROS peut endommager les biomolécules et conduire à des observations erronées dans les expériences SM5,6. Pour prévenir les dommages oxydatifs, les systèmes de récupération d’oxygène (OSS) peuvent être utilisés3,7,8. Le système d’oxydase/catalase de glucose (GODCAT) est efficace pour enlever l’oxygène8,mais il produit des peroxydes potentiellement dommageables comme intermédiaires. Ceux-ci peuvent être préjudiciables aux biomolécules d’intérêt dans les études de SM.
Alternativement, protocatechuate 3,4 dioxygenase (PCD) éliminera efficacement O2 d’une solution aqueuse utilisant son acide protocatechuic de substrat (PCA)7,9. PCD est un métalloenzyme qui utilise le fer nonheme pour coordonner PCA et catalyser la réaction d’ouverture de l’anneau catéchol en utilisant dissous O210. Cette réaction d’une étape s’est avérée être un OSS globalement meilleur pour améliorer la stabilité du fluorophore dans les expériences SM7. Malheureusement, de nombreuses enzymes OSS disponibles dans le commerce, y compris le PCD, contiennent des nucléases contaminantes11. Ces contaminants peuvent endommager les substrats à base d’acide nucléique utilisés dans les expériences SM. Ces travaux permettront d’élucider un protocole de purification à base de chromatographie pour l’utilisation de PCD recombinant dans les systèmes SM. Le PCD peut être largement appliqué à toute expérience où les ROS sont des substrats dommageables nécessaires à l’acquisition de données.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les systèmes de récupération d’oxygène sont généralement inclus dans la microscopie à fluorescence à molécule unique pour réduire le photoblanchiment3,7,8. Ces techniques de microscopie sont souvent utilisées pour observer les acides nucléiques ou les interactions protéiques avec les acides nucléiques1,13,14. La contaminat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par NIH GM121284 et AI126742 à KEY.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | βME |
| 30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Acetic acid, Glacial Certified ACS | Fisherl Chemical | A38C-212 | |
| Agar, Granulated | BD Biosciences | DF0145-17-0 | |
| AKTA FPLC System | GE Healthcare Life Sciences | AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | UFC201024 | 10 kDa MWCO |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma | F-2262 | |
| Ammonium Persulfate (APS) Tablets | Amresco | K833-100TABS | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | DF0123173 | |
| BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract | VWR | 90004-092 | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue | Amresco | 0472-50G | |
| Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate | Bio-Rad | 2240096EDU | |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | PBS |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G37-20 | |
| Granulated LB Broth Miller | EMD Biosciences | 1.10285.0500 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I0250-250G | |
| IPTG | Goldbio | I2481C25 | |
| Leupeptin | Roche | 11017128001 | |
| Lysozyme from Chicken Egg White | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Amresco | 0288-1KG | |
| Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability | Thermo Fisher | ND-2000C | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| Ni-NTA Superflow (100 ml) | Qiagen | 30430 | |
| Novagen BL21 Competent Cells | EMD Millipore | 69-449-3 | SOC media included |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Pepstatin | Gold Biotechnology | P-020-25 | |
| PMSF | Amresco | 0754-25G | |
| Protocatechuic acid | Fisher Scientific | ICN15642110 | PCA |
| Sodium dodecyl sulfate | P212121 | CI-00270-1KG | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devises | ||
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-04 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL | Thermo Fisher Scientific | 09-741-02 | |
| Superose 12 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517301 | |
| TEMED | Amresco | 0761-25ML | |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager | GE Healthcare Life Sciences | ||
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174 (6), 553-557 (1990).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36 (2), 280-290 (2003).
- Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3 (1), 17-25 (2004).
- Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275 (3-6), 367-375 (1992).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216 (1), 49-68 (1990).
- Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82 (14), 6132-6138 (2010).
- Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
- Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12 (10), 901-902 (2015).
- Senavirathne, G., Lopez, M. A., Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539 (7630), 583-587 (2016).
