Царапина Миграция Анализ и Dorsal Skinfold камеры для in Vitro и In Vivo Анализ раны исцеления
Summary
Здесь мы представляем протокол для анализа в пробирке нуля с использованием первичных фибробластов и для in vivo кожи раны заживления анализа у мышей. Оба анализа являются простыми методами для оценки in vitro и in vivo заживления ран.
Abstract
Нарушение кожного заживления ран является серьезной проблемой для пациентов, страдающих диабетом и для пожилых людей, и есть необходимость в эффективном лечении. Соответствующие подходы in vitro и in vivo необходимы для идентификации новых молекул-мишеней для лечения лекарственными препаратами для улучшения процесса заживления ран. Мы определили субъединицу кальциевых каналов с напряжением,загнанные в напряжение (Каве3) в качестве потенциальной целевой молекулы, способной влиять на заживление ран в двух независимых анализах, т.е. в анализе миграции в пробирке и модели камеры in vivo dorsal skinfold. Первичные мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) остро изолированы от дикого типа (WT) и Cav3-дефицитныхмышей (CavNo3 KO) или фибробластов остро изолированы от WT мышей, обработанных siRNA для снижения регулирования экспрессии гена Cacnb3 , кодирование CavNo3, были использованы. Царапина была применена на монослой соединительных клеток, и за закрытием разрыва последовало получение микроскопических изображений в определенных временных точках до полного перераспределения разрыва мигрирующими клетками. Эти изображения были проанализированы, и скорость миграции клеток была определена для каждого состояния. В in vivo анализ, мы имплантировали царской кожи камеры на WT и Cav’3 KO мышей, применяется определенная круговая рана 2 мм диаметром, покрыл рану стеклянным крышкой, чтобы защитить его от инфекций и высыхания, и мониторинг макроскопической замыкания раны с течением времени. Закрытие ран было значительно быстрее у мышей Cacnb3-генно-дефицитных. Потому что результаты in vivo и in vitro assays коррелируют хорошо, анализ in vitro может быть полезен для скрининга высокой пропускной способностью перед проверкой in vitro хитов по модели заживления ран In vivo. То, что мы показали здесьдля диких типа и Cav 3-дефицитных мышей или клеток также может быть применимо к конкретным молекулам, кроме Cav’3.
Introduction
Заживление ран ы кожи начинается сразу после повреждения кожи, чтобы восстановить целостность кожи и защитить организм от инфекций. Процесс заживления ран проходит через четыре перекрывающиеся фазы; коагуляция, воспаление, формирование новых тканей и ремоделированиетканей 1. Миграция ячеек имеет решающее значение на этих этапах. Воспалительные клетки, иммунные клетки, кератиноциты, эндотелиальные клетки и фибробласты активируются в разное время и вторгаются в рануобласти 2. Методы исследования заживления ран in vitro и in vivo представляют большой интерес не только для понимания основных механизмов, но и для тестирования новых препаратов и разработки новых стратегий, направленных на улучшение и ускорение заживления ран ы.
Для мониторинга и анализа миграции клеток можно использовать анализ миграции царапин. Это часто называют in vitro раны заживления анализа. Этот метод требует объекта культуры клеток3. Это простая процедура, нет необходимости в высококачественном оборудовании и анализ может быть выполнен в большинстве лабораторий клеточной биологии. В этом ассоциировании область, свободная от клеток, создается механическим нарушением монослойной клеток, предпочтительно эпителиальных или эндотелиальных клеток или фибробластов. Клетки на краю нуля будут мигрировать для того, чтобы заселить созданный пробел. Количественная оценка уменьшающейся области, свободной от клеток, со временем напоминает скорость миграции и указывает время, которое ячейки должны закрыть разрыв. Для этой цели, исследователи могут использовать либо остро изолированных клеток из WT мышей или мышей, не имеющих гена интереса4, или увековеченные клетки, доступные из надежных хранилищ клеток. Анализ царапин позволяет изучать влияние фармакологически активных соединений или влияние трансинфицированных cDNA или siRNAs на миграцию клеток.
In vivo, заживление ран является сложным физиологическим процессом, требующим различных типов клеток, включая кератиноциты, воспалительные клетки, фибробласты, иммунные клетки и эндотелиальные клетки для того, чтобы восстановить физическую целостность кожи как можно быстрее1 . Различные методы для изучения in vivo заживление ран были разработаны и используются в прошлом5,6,7,8. Дорсальная камера скожа, описанная в этой статье, ранее использовалась для анализов заживления ран9. Он используется в качестве модифицированного складной шкуры подготовки к коже для мышей. Модифицированная модель камеры для стежков имеет ряд преимуществ. 1) Это сводит к минимуму сокращение кожи, что предотвращает наблюдение за процессом заживления ран и может повлиять на восстановление рану у мышей. 2) Эта камера использует покрытие раны со стеклянным покрыванием, снижение инфекций тканей и высыхания, которые могут задержать процесс заживления. 3) Поток крови и васкуляризация могут непосредственно контролироваться. 4) Это позволяет повторяющиеся актуальные применения фармакологически активных соединений и реагентов для того, чтобы лечить рану и ускорить заживление9,10.
Мы определили субъединики высокого напряжения-gated кальциевых каналов (Cav’3) в качестве потенциальной целевой молекулы, чтобы влиять на заживление раны кожи с помощью двух независимых протоколов, т.е. в пробирке нуля миграции анализа и in vivo дорсальный кожной камеры модели. Для анализа in vitro, мы использовали первичные фибробласты, эти клетки выражают ген Cacnb3, кодирующий белок Cav’3, но не имеют деполяризации индуцированной Ca2 “приток или напряжение-зависимых Токов Ca2 “. Мы описали новую функцию Cav’3 в этих фибробластах: Каве3 связывается с инозитол1,4,5-трисфосфатный рецептор (IP3R) и ограничения кальция релиз из эндоплазмической ретикулума. Удаление гена Cacnb3 у мышей приводит к повышенной чувствительности IP3R для IP3, усиленной миграции клеток и увеличению ремонта раны кожи4.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы описываем in vitro и in vivo анализ заживления ран и соотносим полученные результаты. Для анализа in vitro мы использовали первичныефибробласты мыши4,14,15, которые играют важную роль в заживлении ран и ремоделирования тканей…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Петру Вайсгербер и подразделение Transgene животного комплекса SPF (проект P2 SFB 894) медицинского факультета и животное в Институте клинической и экспериментальной хирургии на медицинском факультете Саарлендского университета в Хомбурге. Мы благодарим доктора Андреаса Бека за критическое чтение рукописи. Это исследование было профинансировано Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, проектом A3 для A.B. и V.F.).
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Martin, P. Wound healing–aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2, 2369-2392 (2012).
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology-Cell Physioliology. 301, 272-279 (2011).
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. Journal of Visualized Experiment. (75), e50265 (2013).
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
