Scratch Migration Ssay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro e In Vivo Analisi della Guarigione delle Ferite
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per un saggio in vitro graffio utilizzando fibroblasti primari e per un saggio di guarigione della ferita della pelle in vivo nei topi. Entrambi i test sono metodi semplici per valutare la guarigione delle ferite in vitro e in vivo.
Abstract
La guarigione delle ferite cutanee alterate è una delle principali preoccupazioni per i pazienti affetti da diabete e per le persone anziane, e c’è bisogno di un trattamento efficace. Approcci appropriati in vitro e in vivo sono essenziali per l’identificazione di nuove molecole bersaglio per i trattamenti farmacologici per migliorare il processo di guarigione della ferita cutanea. Abbiamo identificato la sottounità n. 3 di canali di calcio legati alla tensione (Cav-3) come una potenziale molecola bersaglio per influenzare la guarigione della ferita in due saggi indipendenti, vale a dire il saggio di migrazione del graffio in vitro e il modello di camera in vivo dorsale skinfold. Fibroblasti embrionali murici primari (MEF) acutamente isolati da topi selvatici (WT) e cav–3-decisi (Cav–3 KO) o fibroblasti acutamente isolati dai topi WT trattati con siRNA per down-regolare l’espressione del gene Cacnb3 , codificacazione Cavn.3, sono stati utilizzati. Un graffio è stato applicato su un monostrato cellulare confluente e la chiusura del gap è stata seguita prendendo immagini microscopiche in punti temporali definiti fino al ripopolamento completo del divario da parte delle cellule che migrano. Queste immagini sono state analizzate e il tasso di migrazione delle cellule è stato determinato per ogni condizione. In un test in vivo, abbiamo impiantato una camera dorsale a pelli su topi WT e Cav-3 KO, abbiamo applicato una ferita circolare definita di 2 mm di diametro, coperto la ferita con un coperchio di vetro per proteggerla da infezioni e disidratazione, e monitorato la chiusura della ferita macroscopica nel corso del tempo. La chiusura delle ferite è stata significativamente più veloce nei topi carenti di Cacnb3. Poiché i risultati degli esami in vivo e in vitro sono correlati bene, il saggio in vitro può essere utile per lo screening ad alto rendimento prima di convalidare i colpi in vitro del modello di guarigione della ferita in vivo. Ciò che abbiamo mostrato qui per i topi o le cellule di tipo selvatico e Cav–3-deciziali potrebbe essere applicabile anche a molecole specifiche diverse da Cav.
Introduction
La guarigione della ferita cutanea inizia immediatamente dopo la lesione cutanea al fine di ripristinare l’integrità della pelle e per proteggere l’organismo dalle infezioni. Il processo di guarigione della ferita passa attraverso quattro fasi sovrapposte; coagulazione, infiammazione, formazione di nuovi tessuti e rimodellamento dei tessuti1. La migrazione cellulare è fondamentale in queste fasi. Cellule infiammatorie, cellule immunitarie, cheratinociti, cellule endoteliali e fibroblasti vengono attivati in diversi punti temporali e invadono l’area della ferita2. I metodi per studiare la guarigione delle ferite in vitro e in vivo sono di grande interesse non solo per comprendere i meccanismi sottostanti, ma anche per testare nuovi farmaci e per sviluppare nuove strategie che mirano a migliorare e accelerare la guarigione delle ferite della pelle.
Per monitorare e analizzare la migrazione delle celle, è possibile utilizzare il saggio di migrazione scratch. È spesso indicato come analisi di guarigione della ferita in vitro. Questo metodo richiede una struttura di coltura cellulare3. Si tratta di una procedura semplice, non c’è bisogno di attrezzature di fascia alta e il saggio può essere eseguito nella maggior parte dei laboratori di biologia cellulare. In questo saggio, un’area priva di cellule viene creata dall’interruzione meccanica di un monostrato cellulare confluente, preferibilmente cellule epiteliali o fibroblaste endoteliali o fibroblaste. Le celle sul bordo del graffio verranno migrate per ripopolare lo spazio creato. La quantificazione dell’area libera dalle cellule decrescenti nel tempo assomiglia al tasso di migrazione e indica il tempo di cui le cellule hanno bisogno per colmare il divario. A tale scopo, i ricercatori possono utilizzare cellule acutamente isolate da topi O topi WT privi di un gene di interesse4o cellule immortalate disponibili da archivi cellulari affidabili. Il saggio di graffio permette di studiare l’influenza dei composti farmacologicamente attivi o l’effetto dei cDNA trafetti o dei siRNA sulla migrazione cellulare.
In vivo, la guarigione delle ferite è un processo fisiologico complesso, che richiede diversi tipi di cellule tra cui cheratinociti, cellule infiammatorie, fibroblasti, cellule immunitarie e cellule endoteliali al fine di ripristinare l’integrità fisica della pelle il più velocemente possibile1 . Diversi metodi per studiare la guarigione delle ferite in vivo sono stati sviluppati e utilizzati negli ultimi5,6,7,8. La camera dorsale a forma di pelle descritta in questo articolo è stata precedentemente utilizzata per i saggi di guarigione delle ferite9. Viene utilizzato come preparazione a camera dorsale modificata per i topi. Il modello di camera skinfold modificato ha diversi vantaggi. 1) Riduce al minimo la contrazione della pelle, che impedisce l’osservazione del processo di guarigione della ferita e potrebbe influenzare la riparazione della ferita nei topi. 2) Questa camera fa uso di coprire la ferita con un vetrine di vetro, riducendo le infezioni dei tessuti e la disidratazione, che potrebbe ritardare il processo di guarigione. 3) Il flusso sanguigno e la vascolarizzazione possono essere monitorati direttamente. 4) Permette ripetutamente l’applicazione topica di composti e reagenti farmacologicamente attivi al fine di trattare la ferita e accelerare la guarigione9,10.
Abbiamo identificato la sottounità n. 3 di canali di calcio ad alta tensione (Cav-3) come una potenziale molecola bersaglio per influenzare la guarigione della pelle della pelle utilizzando due protocolli indipendenti, vale a dire il saggio di migrazione del graffio in vitro e il modello della camera dorsale in vivo. Per il saggio in vitro, abbiamo usato fibroblasti primari, queste cellule esprimono il gene Cacnb3 che codifica la proteina Cav3, ma mancano di afflusso di Ca2 o di afflusso di tensione. Abbiamo descritto una nuova funzione di Cav-3 in questi fibroblasti: Cav-3 si lega al recettore dell’inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3R) e vincoli di rilascio di calcio dal reticolo endoplasmico. L’eliminazione del gene Cacnb3 nei topi porta ad una maggiore sensibilità dell’IP3R per IP3, a una maggiore migrazione cellulare e ad una maggiore riparazione della pelle4.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, descriviamo un test di guarigione delle ferite in vitro e in vivo e correliamo i risultati ottenuti. Per il saggio in vitro, abbiamo usato fibroblasti di topo primari4,14,15 che svolgono un ruolo importante nella guarigione delle ferite e nella ristrutturazione dei tessuti11. Possono essere utilizzati anche altri tipi di cellule aderenti che crescono come monostrati (ad esempio, cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Dott.ssa Petra Weissgerber e l’Unità Transgene dell’impianto animale SPF (progetto P2 di SFB 894) della Facoltà di Medicina e la struttura animale presso l’Istituto di Chirurgia Clinica e Sperimentale presso la Facoltà di Medicina dell’Università di Saarland, Homburg. Ringraziamo il dottor Andreas Beck per la lettura critica del manoscritto. Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, dal progetto A3 per A.B. e V.F.).
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
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