Burada, primer fibroblastlar kullanarak in vitro çizik testve farelerde in vivo deri yara iyileşmesi test için bir protokol salıyoruz. Her iki tahliller in vitro ve in vivo yara iyileşmesini değerlendirmek için basit yöntemlerdir.
Bozulmuş kutanöz yara iyileşmesi diyabet hastaları ve yaşlılar için önemli bir endişe kaynağıdır ve etkili bir tedaviye ihtiyaç vardır. Uygun in vitro ve in vivo yaklaşımlar cilt yara iyileşme sürecini iyileştirmek için ilaç tedavileri için yeni hedef moleküllerin belirlenmesi için gereklidir. Voltaj kapılı kalsiyum kanallarının β3 alt birimini (Cavβ3) iki bağımsız tahlilde yara iyileşmesini etkileyebilecek potansiyel bir hedef molekül olarak belirledik, yani in vitro çizik göçü tahlilleri ve in vivo dorsal skinfold oda modeli. Birincil fare embriyonik fibroblastlar (MEFs) akut yabani tip (WT) ve Cavβ3-eksik fareler (Cavβ3 KO) veya fibroblastlar akut WT fareler siRNA ile tedavi izole aşağı-Cacnb3 genin ekspresyonunu düzenlemek için izole , Cavβ3 kodlama, kullanılmıştır. Bir çizik bir confluent hücre monolayer üzerine uygulandı ve boşluk kapatma göç eden hücreler tarafından boşluğun tam yeniden popülasyonkadar tanımlanan zaman noktalarında mikroskobik görüntüler alarak izledi. Bu görüntüler analiz edildi ve her durum için hücre geçiş hızı belirlendi. İn vivo bir testte, WT ve Cavβ3 KO farelere bir sırt derisi kalıbı yerleştirdik, 2 mm çapında tanımlanmış dairesel bir yara uyguladık, yarayı enfeksiyonlardan ve kurutunmaya karşı korumak için cam bir kapak kaymasıyla kapladık ve makroskopik yara nın kapanmasını izledik. zaman içinde. Cacnb3-gen eksikliği olan farelerde yara kapanması önemli ölçüde daha hızlıydı. In vivo ve in vitro tahlilsonuçları iyi korelasyon nedeniyle, in vitro tahlil in vivo yara iyileşme modeli ile in vitro isabet doğrulamadan önce yüksek iş itme taraması için yararlı olabilir. Burada yabani tip ve Cavβ3-eksik fareler veya hücreler için gösterdikleri Cavβ3 dışındaki belirli moleküller için de uygulanabilir.
Cildin bütünlüğünü geri getirmek ve organizmayı enfeksiyonlardan korumak için cilt yaralanmasından hemen sonra cilt yaraiyileşmesi başlar. Yara iyileşme süreci dört örtüşen aşamadan geçer; koagülasyon, inflamasyon, yeni doku oluşumu ve doku remodeling1. Hücre göçü bu evrelerde çok önemlidir. İnflamatuar hücreler, bağışıklık hücreleri, keratinositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar farklı zaman noktalarında aktive edilir ve yara bölgesini istila eder2. İn vitro ve in vivo yara iyileşmesini araştırma yöntemleri sadece altta yatan mekanizmaları anlamak için değil, aynı zamanda yeni ilaçları test etmek ve cilt yara iyileşmesini iyileştirmeyi ve hızlandırmayı amaçlayan yeni stratejiler geliştirmek için de büyük ilgi görmektedir.
Hücre geçişini izlemek ve analiz etmek için, sıfırdan geçiş titremi kullanılabilir. Genellikle in vitro yara iyileşmesi tsay olarak adlandırılır. Bu yöntem bir hücre kültür tesisi3gerektirir. Bu basit bir işlemdir, high-end ekipman gerek yoktur ve test çoğu hücre biyolojisi laboratuvarlarında yapılabilir. Bu teşpte, hücresiz bir alan, tercihen epitel veya endotel benzeri hücreler veya fibroblastlar, konfluent hücre monolayer mekanik bozulma tarafından oluşturulur. Çiziğin kenarındaki hücreler, oluşturulan boşluğu yeniden doldurmak için göç eder. Zaman içinde azalan hücresiz alanın niceliği geçiş hızına benzer ve hücrelerin boşluğu kapatmak için ihtiyaç duydukları zamanı gösterir. Bu amaçla, araştırmacılar ya WT fareler veya fareler ilgi4bir gen yoksun akut izole hücreleri kullanabilirsiniz , ya da güvenilir hücre depolarından kullanılabilir ölümsüzleştirilmiş hücreler. Çizik tsay farmakolojik olarak aktif bileşiklerin etkisi veya hücre göçü üzerinde transfected cDNA veya siRNA etkisi incelenmesi sağlar.
In vivo, yara iyileşmesi keratinositler, inflamatuar hücreler, fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tipleri gerektiren karmaşık bir fizyolojik süreçtir mümkün olduğunca hızlı cildin fiziksel bütünlüğünü geri yüklemek için1 . In vivo yara iyileşmesi nde farklı yöntemler geliştirilmiş ve son5,6,7,8. Bu makalede açıklanan dorsal deri odası daha önce yara iyileşmesi tahlilleri için kullanılmıştır9. Bu fareler için modifiye dorsal skinfold oda hazırlığı olarak kullanılır. Modifiye skinfold oda modeli çeşitli avantajları vardır. 1) Yaranın iyileşme sürecini engelleyen ve farelerde yara onarımını etkileyebilecek cilt daralmasını en aza indirir. 2) Bu oda, yaranın cam bir kapak fişi ile kaplanması, doku enfeksiyonlarının azaltılması ve kurutunma, iyileşme sürecini geciktirebilir kullanır. 3) Kan akışı ve vaskülarizasyon doğrudan izlenebilir. 4) Bu yara tedavi etmek ve iyileşme yi hızlandırmak için farmakolojik olarak aktif bileşikler ve reaktifler tekrarlayan topikal uygulama sağlar9,10.
Yüksek gerilim kapılı kalsiyum kanallarının (Cavβ3) β3 alt ünitesini, iki bağımsız protokol, yani in vitro çizik göçü tetkik ve in vivo dorsal skinfold oda modeli ile cilt yara iyileşmesini etkileyebilecek potansiyel bir hedef molekül olarak tanımladık. İn vitro tetkik için, birincil fibroblastlar kullandık, bu hücreler Cavβ3 proteinini kodlayan Cacnb3 genini ifade eder, ancak depolarizasyona bağlı Ca2+ akını veya voltaj bağımlı Ca2+ akımları yoktur. Bu fibroblastlarda Cavβ3’ün yeni bir işlevini tanımladık: Cavβ3 inositol 1,4,5-trisfosfat reseptörüne (IP3R) bağlanır ve endoplazmik retikulumdan kalsiyum salınımını kısıtlar. Farelerde Cacnb3 geninin silinmesi IP3R IP3R artan duyarlılık yol açar, gelişmiş hücre göçü ve artan deri yara onarımı 4.
Bu yazıda in vitro ve in vivo yara iyileşmesi tahsinini açıklar ve elde edilen sonuçları ilişkilendiriz. In vitro tsay için, biz yara iyileşmesi ve doku remodeling önemli bir rol oynayan birincil fare fibroblastlar4,14,15 kullanılır11. Monolayers olarak büyüyen diğer yapışık hücre tipleri (örn. epitel hücreleri, endotel hücreleri, keratinositler) de kullanılabilir. Uygun ve sağlık…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Petra Weissgerber’e ve Tıp Fakültesi’nin SPF hayvan tesisinin Transgen Birimi’ne (SFB 894’ün P2 projesi) ve Homburg’daki Saarland Üniversitesi Tıp Fakültesi Klinik ve Deneysel Cerrahi Enstitüsü’ndeki hayvan tesisine teşekkür ederiz. Dr. Andreas Beck’e el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, Proje A3 a.B. ve V.F. tarafından finanse edilmiştir.
0.9 % NaCl | |||
1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
6 well plate | Corning | 3516 | |
Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
Depilation cream | any depilation cream | ||
Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
Hexagon full nut | |||
Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
Micro-forceps | |||
Micro-Scissors | |||
Mouse restrainer | Home-made | ||
Normal scissors | |||
Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
Polypropylene sutures | |||
Screwdriver | |||
Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
Slotted cheese head screw | |||
Snap ring | |||
Snap ring plier | |||
Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
Wire piler |