वीवो में एंडोथेलियल सेल से आरएनए अलगाव के लिए रिबोसोम एफ़िनिटी शुद्धि (टीआरईआरई) का अनुवाद
Summary
हम संवहनी endothelial कोशिकाओं से राइबोसोम बाध्य MRNA शुद्ध करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत (ईसी) सीधे माउस मस्तिष्क में, फेफड़ों और दिल के ऊतकों में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विशिष्ट आनुवंशिक टैग के माध्यम से (EGFP) आरएनए शुद्धि के साथ संयोजन में ribosomes .
Abstract
कई अध्ययनों में इन विट्रो सेलुलर assays और पूरे ऊतकों का उपयोग करने के लिए सीमित किया गया है या में ट्रांसट्रो और जीन अभिव्यक्ति के in vitro विश्लेषण के लिए जानवरों से विशिष्ट सेल प्रकार के अलग-अलग QPCR और आरएनए अनुक्रमण द्वारा. जटिल ऊतकों और अंगों में विशिष्ट कोशिका प्रकार के व्यापक ट्रांसक्रिप्टोम और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सेलुलर और आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण होंगे जिसके द्वारा जीन विनियमित होते हैं और ऊतक होमोस्टेसिस और अंग के साथ उनका संबंध होता है कार्यों. इस लेख में, हम एक उदाहरण के रूप में पशु फेफड़ों के संवहनी endothelia में सीधे vivo में ribosome बाध्य आरएनए के अलगाव के लिए पद्धति का प्रदर्शन. विशिष्ट सामग्री और ऊतक प्रसंस्करण और आरएनए शुद्धि के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया जाएगा, आरएनए गुणवत्ता और उपज के मूल्यांकन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से arteriogenic जीन assays के लिए वास्तविक समय QPCR सहित. इस दृष्टिकोण, राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (ट्रैप) तकनीक का अनुवाद के रूप में जाना जाता है, जीन अभिव्यक्ति और जटिल ऊतकों में किसी भी विशिष्ट प्रकार में सीधे विवो में कुछ सेल प्रकार के transcriptome विश्लेषण की विशेषता के लिए उपयोग किया जा सकता है.
Introduction
स्तनधारी मस्तिष्क, हृदय और फेफड़े जैसे जटिल ऊतकों में, सेलुलर विषमता के उच्च स्तर पूरे ऊतक नमूनों से प्राप्त जीन अभिव्यक्ति डेटा के विश्लेषण को जटिल बनाते हैं। विवो में एक विशेष सेल प्रकार में जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का निरीक्षण करने के लिए, एक नई पद्धति हाल ही में विकसित किया गया है, जो किसी भी आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल प्रकार के पूरे अनुवादित MRNA पूरक की पूछताछ की अनुमति देता है. इस पद्धति को अनुवाद ी राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (ट्रैप) तकनीक1,2के रूप में जाना जाता है। यह जानवरों में आनुवंशिक रूप से अन्य एंजियोजेनेसिस-संबद्ध जीनों के साथ संयुक्त होने पर एंडोथेलियल सेल जीव विज्ञान और एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
हमने दिखाया है कि एंजियोजेनिक पीकेडी-1 सिगनल और एंजियोजेनिक जीन सीडी36 का प्रतिलेखन एंडोथेलियल सेल (ईसी) विभेद और कार्यात्मक एंजियोजेनेसिस3,4,5,6के लिए महत्वपूर्ण है। जीन प्रतिलेखन और ईसी transdifferentiation में angiogenic और चयापचय संकेतन के आणविक तंत्र निर्धारित करने के लिए, हम TRAP तकनीक के आधार पर विशेष रूप से नष्ट angiogenic जीन के साथ आनुवंशिक रूप से इंजीनियर TRAP चूहों बनाया है1 , 2. इसके अलावा, हमारे TRAP जानवरों में, न केवल वे संवहनी endothelia या cd36 जीन के वैश्विक विलोपन में pkd-1 या cd36 जीन की कमी है, लेकिन एक बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) भी आनुवंशिक रूप से टैग किया गया है पर चुनाव आयोग राइबोसोम का अनुवाद कर रहा है। TRAP लक्षित ऊतकों के संवहनी endothelia से सीधे ribosome-बाउंड MRNA के आत्मीयता शुद्धि की अनुमति देता है, जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण और नए transcriptomes कि चुनाव आयोग भेदभाव के साथ जुड़े रहे हैं की पहचान को सक्षम करने और विवो स्थितियों में सीधे एंजियोजेनेसिस। हम सफलतापूर्वक इन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जानवरों में endothelia से राइबोसोम बाध्य आरएनए अलग है. शुद्ध आरएनए का उपयोग ईसी विभेदऔर कार्यों के विनियमन में एंजियोजेनिक या धमनीजन जीनों के आगे की विशेषता के लिए किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल सीधे vivo में ECs में MRNA के अलगाव के लिए TRAP दृष्टिकोण को लागू करने के लिए एक कदम दर कदम गाइड प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एंजियोजेनेसिस एक जटिल बहुचरणी प्रक्रिया है, जिसमें ईसी-विशिष्ट एंजियोजेनिक जीन प्रतिलेखन और अभिव्यक्तिईसी विभेद न होने और एंजियोजेनिक रीप्रोग्रामिंग 3, 4 में एक अनिवार्य भूमिका निभाती<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डॉ रेन काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (13SDG14800019) द्वारा समर्थित है; बीआर), एन की आशा फाउंडेशन (FP00011709; बीआर), अमेरिकन कैंसर सोसायटी (86-004-26; MCW कैंसर केंद्र बीआर के लिए), और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (HL136423; बीआर; जॉर्डन Palmer द्वारा समर्थित है 2018 MCW CTSI 500 सितारे इंटर्नशिप कार्यक्रम; पी मोरन NHLBI (5T35 HL072483-34) से एक संस्थागत अनुसंधान प्रशिक्षण अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
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