Übersetzen von Ribososomen-Affinitätsreinigung (TRAP) zur RNA-Isolierung von Endothelzellen In vivo
Summary
Wir präsentieren einen Ansatz zur Reinigung ribossomengebundener mRNA aus vaskulären Endothelzellen (ECs) direkt im Gehirn, der Lunge und im Herzgewebe der Maus über das EC-spezifische genetische Tag des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (EGFP) in Ribosomen in Kombination mit RNA-Reinigung .
Abstract
Viele Studien beschränkten sich auf die Verwendung von in vitro zellulären Assays und ganzen Geweben oder die Isolierung bestimmter Zelltypen von Tieren zur In-vitro-Analyse von Transkriptom und Genexpression durch qPCR- und RNA-Sequenzierung. Umfassende Transkriptom- und Genexpressionsanalyse spezifischer Zelltypen in komplexen Geweben und Organen wird entscheidend sein, um zelluläre und molekulare Mechanismen zu verstehen, durch die Gene reguliert werden, und ihre Assoziation mit Gewebehomöostase und Organ Funktionen. In diesem Artikel zeigen wir als Beispiel die Methodik zur Isolierung ribosomgebundener RNA direkt in vivo in der vaskulären Endothelie der Tierlunge. Die spezifischen Materialien und Verfahren für die Gewebeverarbeitung und RNA-Reinigung werden beschrieben, einschließlich der Bewertung der RNA-Qualität und -Ausbeute sowie der Echtzeit-qPCR für arteriogene Gen-Assays. Dieser Ansatz, der als Übersetzung der Ribosomen-Affinitätsreinigung (TRAP)-Technik bekannt ist, kann zur Charakterisierung der Genexpression und Transkriptomanalyse bestimmter Zelltypen direkt in vivo in jedem spezifischen Typ in komplexen Geweben verwendet werden.
Introduction
In komplexen Geweben wie Gehirn, Herz und Lunge erschweren die hohen Zellheterogenitätdien die Analyse von Genexpressionsdaten aus ganzen Gewebeproben. Um Genexpressionsprofile in einem bestimmten Zelltyp in vivo zu beobachten, wurde kürzlich eine neue Methodik entwickelt, die die Abfrage der gesamten übersetzten mRNA-Ergänzung eines genetisch definierten Zelltyps ermöglicht. Diese Methode wird als die übersetzende Ribosome Affinitätsreinigung (TRAP) Technik1,2bekannt. Es ist ein nützliches Werkzeug, um Endothelzellbiologie und Angiogenese in Kombination mit genetisch manipulierender anderer Angiogenese-assoziierter Gene bei Tieren zu untersuchen.
Wir haben gezeigt, dass angiogene PKD-1-Signalisierung und die Transkription des angiogenen Gens CD36 für die Endothelzelldifferenzierung (EC) und funktionelle Angiogenese3,4,5,6entscheidend sind. Um molekulare Mechanismen der angiogenen und metabolischen Signalisierung in der Gentranskription und der EG-Transdifferenzierung zu bestimmen, haben wir gentechnisch veränderte TRAP-Mäuse mit speziell gelöschten angiogenen Genen auf der Grundlage der TRAP-Technik1 erstellt. , 2. Darüber hinaus haben sie bei unseren TRAP-Tieren nicht nur pkd-1- oder cd36-Genmangel in der vaskulären Endothelie oder die globale Deletion des cd36-Gens, sondern ein verbessertes grünes Fluoreszenzprotein (EGFP) ist auch genetisch auf Die übersetzenden Ribosomen der EG. TRAP ermöglicht die Affinitätsreinigung von ribosomgebundener mRNA direkt aus der vaskulären Endothelie von Zielgeweben, was die Analyse der Genexpression und die Identifizierung neuer Transkriptome ermöglicht, die mit der EG-Differenzierung und Angiogenese direkt unter in vivo-Bedingungen. Wir haben bei diesen gentechnisch veränderten Tieren erfolgreich ribosomgebundene RNA aus der Endothelie isoliert. Die gereinigte RNA kann zur weiteren Charakterisierung angiogener oder arteriogener Gene bei der Regulation von EG-Differenzierung und -Funktionen verwendet werden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Implementierung des TRAP-Ansatzes zur Isolierung von mRNA in ECs direkt in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Angiogenese ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, bei dem DIE EC-spezifische angiogene Gentranskription und -expression eine wesentliche Rolle bei der EG-Differenzierung und angiogenen Reprogrammierung3,4spielen. Um die Barrieren aus der zellulären Vielfalt und architektonischen Komplexität zu überwinden, um die Funktion des Säugetiergefäßsystems auf molekularer Ebene in vivo besser zu verstehen, haben wir EC-spezifische TRAP-Mäuse geschaffen, beglei…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Rens Arbeit wird von der American Heart Association (13SDG14800019; BR), der Ann es Hope Foundation (FP00011709; BR), die American Cancer Society (86-004-26; das MCW Cancer Center to BR) und das National Institute of Health (HL136423; BR); Jordan Palmer wird vom MCW CTSI 500 Stars Internship Program 2018 unterstützt; P. Moran wird von einem Institutional Research Training Grant von NHLBI (5T35 HL072483-34) unterstützt.
Materials
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer with Nanochips and Picochips | Agilent | G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.1832 | |
| Homogenizers | Fisher Scientific | K8855100020 | |
| Magnet (Dynamag-2) | Invitrogen | 123-21D | Will depend on purification scale; samples in 1.5-mL tubes can be concentrated on a DynaMag-2 |
| Minicentrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| NanoDrop 2000C spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5430R | with rotor for 1.5-mL microcentrifuge tubes |
| RNase-free 1.5mL microcentrifuge tubes | Applied Biosystems | AM12450 | |
| Rnase-free 50-mL conical tubes | Applied Biosystems | AM12501 | |
| RNase-free 1000-μl filter tips | Rainin | RT-1000F | |
| RNase-free 200-μl filter tips | Rainin | RT-200F | |
| RNase-free 20-μl filter tips | Rainin | RT-20F | |
| Rotor for homogenizers | Yamato | LT-400D | |
| Tube rotator, Labquake brand | Thermo Fisher | 13-687-12Q |
References
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).
- Zhou, P., et al. Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).
- Best, B., Moran, P., Ren, B. VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan. Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).
- Ren, B., et al. LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming. Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).
- Ren, B. Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37 (2016).
- Ren, B. FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?. Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).
- Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model. Nucleic Acids Research. 42, e14 (2014).
- Dong, L., et al. Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling. Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).
- Ren, B., et al. ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).
- Skuli, N., et al. Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes. Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).
