मानव ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी और Vitrification
Summary
ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी और विट्रीफिकेश को प्रीइम्प्लांटेशन जेनेटिक परीक्षण को कुशलतापूर्वक संचालित करने की आवश्यकता होती है। एक दृष्टिकोण जोना pellucida के अनुक्रमिक खोलने और दिन में 7-8 trophectoderm कोशिकाओं की बहाली पर जोर देते हुए 5-7 के बाद गर्भाधान दोनों जोड़तोड़ की संख्या की आवश्यकता है और उप इष्टतम पर्यावरण की स्थिति के लिए भ्रूण के जोखिम को सीमित करता है.
Abstract
Blastcyst बायोप्सी preimplantation आनुवंशिक परीक्षण के साथ आईवीएफ चक्र के दौरान एक विश्वसनीय आनुवंशिक निदान प्राप्त करने के लिए किया जाता है। फिर, आदर्श कार्यप्रवाह नैदानिक तकनीकों के टर्नअराउंड समय के कारण और निम्नलिखित प्राकृतिक चक्र में एक शारीरिक एंडोमेट्रियम पर चयनित भ्रूण (एस) को स्थानांतरित करने के लिए एक सुरक्षित और कुशल vitrification प्रोटोकॉल पर जोर देता है। एक बायोप्सी दृष्टिकोण जोना pellucida के अनुक्रमिक खोलने और 5-10 trophectoderm कोशिकाओं की बहाली को शामिल (आदर्श रूप से 7-8) दोनों जोड़तोड़ की संख्या की आवश्यकता है और उप इष्टतम पर्यावरण की स्थिति के लिए भ्रूण के जोखिम को सीमित करता है. उचित प्रशिक्षण के बाद, इस तकनीक बायोप्सी के समय के मामले में विभिन्न ऑपरेटरों भर में reproduible था ($8 मिनट, 3-22 मिनट प्रति डिश बायोप्सी के लिए भ्रूण की संख्या के आधार पर लेकर), निर्णायक निदान प्राप्त ($97.5%) और vitrified-warmed euploid blastcyst हस्तांतरण के बाद जीवित जन्म दर (gt; 40%)। बायोप्सी, vitrification और वार्मिंग के बाद जीवित रहने की दर के रूप में 99.8% के रूप में उच्च था. वार्मिंग से 1.5 एच पर फिर से विस्तार दर 97% के रूप में उच्च के रूप में था, काफी हद तक बायोप्सी और vitrification के बीच समय पर निर्भर (आदर्श रूप से $ 30 मिनट), blastcyst रूपात्मक गुणवत्ता और बायोप्सी के दिन. सामान्य में, यह एक ढह blastcyst vitrify करने के लिए बेहतर है; इसलिए, गैर-पीजीटी चक्र में, लेजर की मदद से कृत्रिम संकुचन cryopservation से पहले भ्रूण पतन प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है। सबसे होनहार भविष्य के परिप्रेक्ष्य भ्रूण डीएनए के एक putative स्रोत के रूप में blastcyst संस्कृति के बाद आईवीएफ संस्कृति मीडिया के गैर इनवेसिव विश्लेषण है. हालांकि, इस संभावित avant-garde अभी भी जांच के तहत है और एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल अभी तक परिभाषित और मान्य करने की जरूरत है.
Introduction
आधुनिक मानव भ्रूण विज्ञान का मुख्य लक्ष्य प्रेरित चक्र प्रति संख्या लाइव जन्मों को अधिकतम करने और लागत, समय और एक गर्भावस्था को प्राप्त करने के प्रयासों को कम करने के लिए है। इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, भ्रूण चयन के लिए मान्य दृष्टिकोण एक आईवीएफ चक्र के दौरान प्राप्त एक सहगण के भीतर प्रजनन सक्षम भ्रूण की पहचान करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए. नवीनतम सबूत के अनुसार, blastcyst संस्कृति1 व्यापक गुणसूत्र परीक्षण और vitrified-warmed euploid भ्रूण हस्तांतरण (ईटी) के साथ संयुक्त आईवीएफ दक्षता2बढ़ाने के लिए सबसे कुशल रूपरेखा है। स्पष्ट रूप से, एनुलॉयडी परीक्षण के लिए एक भ्रूण ीय नमूना की आवश्यकता होती है, जो वर्तमान में ज्यादातर ट्रोफीक्टोडरम (टीई) से प्राप्त कुछ कोशिकाओं से प्रतिनिधित्व करता है, यानी ब्लास्टोसिस्ट का खंड जो गर्भावस्था के दौरान भ्रूण annexes (जैसे, प्लेसेंटा) को मूल देता है . केरियोटाइप विश्लेषण के अलावा, एकल जीन उत्परिवर्तनों का मूल्यांकन एक नैदानिक रणनीति के भाग के रूप में एक टीई बायोप्सी से किया जा सकता है जिसे प्रीइम्प्लांटेशन जेनेटिक टेस्टिंग (पीजीटी; ए ए ए ए ए ए, संरचनात्मक गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था के लिए, मोनोजेनिक रोगों के लिए -एम)। पिछले दशकों में अन्य अंडाणु/भ्रूण बायोप्सी विधियों को सिद्धांतीकृत किया गया है और नैदानिक रूप से अपनाया गया है, अर्थात् ध्रुवीय शरीर बायोप्सी और ब्लास्टोमेर बायोप्सी। हालांकि, उनके उपयोग आजकल कम हो गया है क्योंकि उनके प्रक्रियात्मक कमियां (उदाहरण के लिए, उच्च कार्यभार और प्रजनन प्रभाव के लिए जोखिम) और नैदानिक सीमाओं (जैसे, एकल सेल विश्लेषण मुद्दों) स्पष्ट रूप से लागत, जोखिम और के बीच एक पर्याप्त संतुलन में बाधा लाभ (एक समीक्षा के लिए देखें3).
इस कागज में, TE बायोप्सी के लिए मुख्य प्रोटोकॉल में से एक अच्छी तरह से बाद vitrification, वार्मिंग और हस्तांतरण प्रक्रियाओं की आवश्यकता के साथ एक साथ वर्णित है. यहाँ रेखांकित वर्कफ़्लो एक व्यस्त PGT इकाई के लिए आदर्श है.
जैसा कि पहले से ही हमारे समूह4,5द्वारा वर्णित है , प्रक्रिया पूरी तरह से विस्तारित blastcysts के zona pellucida के अनुक्रमिक खोलने और कुछ टीई कोशिकाओं को हटाने शामिल है (औसत 7-8 पर). दिन की तुलना में 3 लेजर की मदद से हैचिंग आधारित blastcyst बायोप्सी विधि6,इस प्रक्रिया को एक आईवीएफ इकाई के दैनिक कार्यक्रम को कम कर सकता है जहां नाजुक प्रक्रियाओं, जैसे ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी और vitrification, समय पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए। जैसे ही ब्लास्टोसिस्ट अपने पूर्ण विस्तार तक पहुंचता है, बायोप्सी को हटाने के लिए टीई कोशिकाओं का चयन करके किया जा सकता है, जिससे आंतरिक सेल द्रव्यमान (आईसीएम) के हर्निया के जोखिम को रोका जा सकता है, जो अन्यथा प्रक्रिया को चुनौतीदेने प्रदान करेगा। साहित्य में ब्लास्टोसिस्ट बायोप्सी के तीसरे प्रोटोकॉल का भी वर्णन किया गया है, जिसमें लेजर की मदद से हैचिंग की जा रही है एक बार भ्रूण पहले से ही ब्लास्टोसिस्ट चरण तक पहुंच गया है, प्रक्रिया5,7से कुछ घंटे पहले। हालांकि, इस दृष्टिकोण और अधिक समय लेने वाली है और मुख्य रूप से आईवीएफ इकाइयों है कि सीमित अनुभवी ऑपरेटरों के हाथों में ते बायोप्सी को लागू कर रहे हैं और एक मध्यम कम दैनिक कार्यभार के मद्देनजर सूट.
आईवीएफ में आनुवंशिक विश्लेषण करने का लक्ष्य रखने पर इंट्रासाइटोप्लाज्मा शुक्राणु इंजेक्शन (आईसीएसआई)8 को एक समेकित तकनीक होनी चाहिए। इसी तरह, ब्लास्टोसिस्ट चरण के लिए भ्रूणों को सुरक्षित रूप से काटने के लिए एक उचित संस्कृति प्रणाली टीई बायोप्सी रणनीति के कार्यान्वयन के लिए महत्वपूर्ण है। पर्याप्त संख्या में इनक्यूबेटर, साथ ही कम ऑक्सीजन तनाव का उपयोग इस अंत के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताएँ हैं, ब्लास्टोसिस्ट दर9से समझौता नहीं करने के लिए। एक ही समय में, एक कुशल cryopservation कार्यक्रम के लिए सुरक्षित रूप से एक पीजीटी चक्र का प्रबंधन की जरूरत है. पिछले दशक में, vitrification के कार्यान्वयन भ्रूण cryo-survival दरों को भी बढ़ाया गया है और तक 99%10,11. यह आनुवंशिक परीक्षण करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान की है और निम्नलिखित मासिक धर्म चक्र के लिए भ्रूण हस्तांतरण स्थगित, एक गैर उत्तेजित और शायद अधिक ग्रहणशील एंडोमेट्रियम12पर.
दोनों ते बायोप्सी और vitrification कड़े कौशल की आवश्यकता कार्यों की मांग कर रहे हैं और उनके प्रभाव अनुभवहीन ऑपरेटरों भर में भिन्न हो सकते हैं. इसलिए प्रत्येक ऑपरेटर को इन प्रक्रियाओं को चिकित्सकीय रूप से करने की अनुमति देने से पहले एक विशिष्ट प्रशिक्षण अवधि की वकालत की जाती है; इसके अलावा, ऑपरेटरों के कौशल के रखरखाव का समय-समय पर क्रायोप्रेक्षण और बायोप्सी प्रक्रियाओं के लिए प्रमुख प्रदर्शन संकेतकों (KPI) की निगरानी करके मूल्यांकन किया जाना चाहिए। प्रत्येक आईवीएफ क्लिनिक इस अंत करने के लिए आंतरिक KPIs सेट करना चाहिए, जो अंतरराष्ट्रीय consortia द्वारा प्रकाशित लोगों का अनुमान है और /
ते बायोप्सी, vitrification-वार्मिंग और साक्षी प्रक्रियाओं हमारी इकाई में तकनीक मान्य कर रहे हैं, कि सभी शामिल ऑपरेटरों भर में मानकीकृत किया गया है के रूप में तीन पिछले प्रकाशनों में रिपोर्ट11,13,14 .
Protocol
Representative Results
Discussion
केवल अच्छी तरह से अनुभवी कुशल भ्रूण विज्ञानी जिन्होंने अपनी प्रशिक्षण अवधि पूरी कर ली है, उन्हें ते बायोप्सी और ब्लास्टोसिस्ट विट्रीफिकेश दोनों को करना चाहिए। इसके अलावा, एक गवाह प्रक्रियाओं की निगर…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एजी और आरएम ने आंकड़े एकत्र किए और पांडुलिपि का मसौदा तैयार किया। डीसी ने आंकड़ों का विश्लेषण किया, प्रतिनिधि परिणामों का मसौदा तैयार किया, आंकड़ों का प्रदर्शन किया और पांडुलिपि को संशोधित किया। एफएमयू और एलआर ने परिणामों और पूरी पांडुलिपि की समीक्षात्मक चर्चा प्रदान की।
Materials
| Equipment | |||
| Cold tube rack | Biocision | XTPCR96 | |
| Electronic pipette controller | Fisher Scientific | 710931 | |
| Flexipet adjustable handle set | Cook | G18674 | Stripper holder |
| Gilson Pipetman | Gilson | 66003 | p20 |
| IVF Electronic Witness System | CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions | RI Witness ART Management System | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
| Laminar Flow Hood | IVF TECH | Grade A air flow | |
| Laser objective | RI | Saturn 5 | |
| Microinjectors | Nikon Narishige | NT-88-V3 | |
| Mini centrifuge for PCR tubes | Eppendorf | CSLQSPIN | for 0.2ml PCR tubes |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M80 | |
| Thermostat | Panasonic | MCO-5AC-PE | |
| Tri-gas incubator | Panasonic | MCO-5M-PE | 02/CO2 |
| Consumables | |||
| Biopsy pipette | RI | 7-71-30FB35720 | 30µm ID, flat 35°C |
| Cryolock | Cryolock | CL-R-CT | |
| CSCM complete | Irvine Scientific | 90165 | IVF culture medium supplemented with HSA |
| Embryo Transfer Catheter | Cook | G17934 | |
| Flexipet pipette | Cook | G26712 | 140µm stripping pipette tip |
| Flexipet pipette | Cook | G46020 | 300µm stripping pipette tips |
| Holding pipette | RI | 7-71-IH35/20 | 30µm ID, flat 35°C |
| Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 9988 | |
| IVF One well dish | Falcon | 353653 | |
| Mineral Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Modified HTF Medium | Irvine Scientific | 90126 | Hepes-Buffered medium |
| Nuclon Delta Surface | Thermofisher scientific | 176740 | IVF dish 4-well plate with sliding lid |
| Primaria Cell culture dish | Corning | 353802 | 60x15mm |
| Reproplate | Kitazato | 83016 | |
| Serological pipette | Falcon | 357551 | 10ml |
| Sterile disposable Gilson tips | Eppendorf | 0030 075.021 | 200µl |
| Tubing Kit | Provided by the genetic lab | PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution | |
| Vitrification media | Kitazato | VT801 | Equilibration and vitrification solutions |
| Warming media | Kitazato | VT802 | Thawing and dilution solutions |
References
- Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
- McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
- Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
- Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
- Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
- Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
- Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
- Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
- Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
- de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
- Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
- McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
- Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
- Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
- Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
- Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
- Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).
