Summary

Biopsia e vetrificazione dell'esplosione umana

Published: July 26, 2019
doi:

Summary

La biopsia e la vitrificazione della blastocisti sono necessarie per condurre in modo efficiente i test genetici preimpianto. Un approccio che prevede l’apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 7-8 cellule di trectodermi nel giorno 5-7 post-inseminazione limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l’esposizione dell’embrione a condizioni ambientali non ottimali.

Abstract

La biopsia Blastocyst viene eseguita per ottenere una diagnosi genetica affidabile durante i cicli di fecondazione in vitro con test genetici preimpianto. Quindi, il flusso di lavoro ideale comporta un protocollo di vitrificazione sicuro ed efficiente, a causa dei tempi di consegna delle tecniche diagnostiche e per trasferire l’embrione o gli embrioni selezionati su un endometrio fisiologico in un ciclo naturale successivo. Un approccio di biopsia che comprende l’apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 5-10 cellule trophectoderm (idealmente 7-8) limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l’esposizione dell’embrione a condizioni ambientali non ottimali. Dopo un’adeguata formazione, la tecnica è stata riproducibile tra diversi operatori in termini di tempistica della biopsia (8 min, che vanno da 3 a 22 min in base al numero di embrioni alla biopsia per piatto), diagnosi conclusive ottenute (97,5%) e tassi di natalità vivi dopo il trasferimento di blastocisti euploidi vetrificati (>40%). Il tasso di sopravvivenza dopo la biopsia, la vitrificazione e il riscaldamento è stato del 99,8%. Il tasso di riespansione a 1,5 h dal riscaldamento era alto come 97%, in gran parte dipende dalla tempistica tra biopsia e vitrificazione (idealmente , 30 min), qualità morfologica blastocista e giorno della biopsia. In generale, è meglio vitrificare una blastocisti collassata; pertanto, nei cicli non PGT, potrebbe essere eseguito un restringimento artificiale assistito al laser per indurre il collasso dell’embrione prima della crioconservazione. La prospettiva futura più promettente è l’analisi non invasiva dei media di coltura della fecondazione in vitro dopo la coltura della blastocisti come fonte putativa di DNA embrionale. Tuttavia, questa potenziale avanguardia è ancora in fase di studio e un protocollo affidabile deve ancora essere definito e convalidato.

Introduction

L’obiettivo principale dell’embriologia umana moderna è quello di massimizzare il numero di nascite vive per ciclo stimolato e ridurre i costi, i tempi e gli sforzi per raggiungere una gravidanza. Per raggiungere questo obiettivo, dovrebbero essere utilizzati approcci convalidati per la selezione degli embrioni per identificare gli embrioni competenti riproduttivi all’interno di una coorte ottenuta durante un ciclo di fecondazione in vitro. Secondo le ultime evidenze, la cultura blastocisti1 combinata con test cromosomici completi e il trasferimento di embrioni euploidi vetrificati (ET) è il quadro più efficiente per aumentare l’efficienza della fecondazione in vitro2. Chiaramente, il test di aneuploidità richiede un campione embrionale, che attualmente è per lo più rappresentato da poche cellule recuperate dal trhectoderm (TE), cioè la sezione del blastocisti che dà origine agli annessi embrionali (ad esempio, la placenta) durante la gravidanza . Oltre all’analisi del cariotipo, anche le mutazioni genetiche singole potrebbero essere valutate da una biopsia TE come parte di una strategia clinica nota come test genetico preimpianto (PGT; -A per le aneuploidies, -SR per riarrangiamento cromosomiche strutturali, -M per le malattie monogeniche). Altri metodi di biopsia oocite/embrione sono stati teorizzati e adottati clinicamente negli ultimi decenni, vale a dire biopsia di corpi polari e biopsia blastomeri. Tuttavia, il loro uso è ancora ridotto al giorno d’oggi, poiché i loro inconvenienti procedurali (ad esempio, maggiore carico di lavoro e rischio di impatto riproduttivo) e le limitazioni diagnostiche (ad esempio, problemi di analisi a cella singola) ostacolano implicitamente un equilibrio sufficiente tra costi, rischi e benefici (per una revisione vedere3).

In questo documento, uno dei principali protocolli per la biopsia TE è accuratamente descritto insieme alle successive procedure di vitrificazione, riscaldamento e trasferimento necessarie. Il flusso di lavoro qui descritto è ideale per un’unità PGT occupata.

Come già descritto in precedenza dal nostro gruppo4,5, la procedura prevede l’apertura sequenziale della zona pellucida di blastocisti completamente espansi e la rimozione di poche cellule TE (in media 7-8). Rispetto al giorno 3 metodo di biopsia di schiusa-assistita da raggi6, questa procedura potrebbe facilitare l’orario giornaliero di un’unità di fecondazione in vitro in cui devono essere eseguite tempestivamente procedure delicate, come la biopsia blastocisti e la vitrificazione. Non appena la blastocisti raggiunge la sua piena espansione, la biopsia può essere effettuata selezionando le cellule TE da rimuovere, impedendo così il rischio di ernia della massa cellulare interna (ICM), che altrimenti renderebbe la procedura impegnativa. In letteratura, è stato descritto anche un terzo protocollo di biopsia di blastocisti, che comporta la schiusa assistita dal laser eseguita una volta che l’embrione ha già raggiunto lo stadio di blastocisti, poche ore prima della procedura5,7. Tuttavia, questo approccio richiede più tempo e si adatta principalmente alle unità di fecondazione in vitro che implementano la biopsia TE nelle mani di operatori con esperienza limitata e in considerazione di un carico di lavoro giornaliero moderato-basso.

L’iniezione intracitoplasmatica di spermatoi (ICSI)8 dovrebbe essere una tecnica consolidata se si mira a condurre analisi genetiche nella fecondazione in vitro. Allo stesso modo, un sistema di coltura adeguato per raccogliere in modo sicuro gli embrioni allo stadio di blastocisti è fondamentale per l’attuazione della strategia di biopsia TE. Un numero adeguato di incubatori, così come l’uso di bassa tensione di ossigeno sono prerequisiti fondamentali a tal fine, per non compromettere il tasso di blastocisti9. Allo stesso tempo, è necessario un programma di crioconservazione efficiente per gestire in modo sicuro un ciclo PGT. Nell’ultimo decennio, l’attuazione della vetrificazione ha aumentato i tassi di crio-sopravvivenza degli embrioni anche fino a >99%10,11. Ciò ha fornito tempo sufficiente per eseguire test genetici e rinviare il trasferimento dell’embrione al successivo ciclo mestruale, su un endometrio non stimolato e probabilmente più ricettivo12.

Sia la biopsia TE che la vitrificazione richiedono attività rigorose e la loro efficacia può variare a seconda degli operatori non esperti. Si propongono pertanto un periodo di formazione specifico prima di consentire a ciascun operatore di eseguire clinicamente queste procedure; inoltre, il mantenimento delle competenze degli operatori dovrebbe essere valutato periodicamente monitorando gli indicatori chiave di prestazione (KPI) per le procedure di crioconservazione e biopsia. Ogni clinica di fecondazione in vitro dovrebbe fissare KPI interni a tal fine, che deve approssimare quelli pubblicati dai consorzi internazionali e/o i risultati pubblicati dai laboratori di riferimento.

La biopsia TE, il riscaldamento della vitrificazione e le procedure di testimonianza sono tecniche convalidate presso la nostra unità, che sono state standardizzate in tutti gli operatori coinvolti come riportato in tre precedenti pubblicazioni11,13,14 .

Protocol

Il protocollo per la biopsia della blastocisti umana, qui descritto, segue le linee guida del Comitato Etico della ricerca umana G.EN.E.R.A. NOT:</ Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i materiali necessari. Ulteriori materiali necessari riguardano calzature e abiti da laboratorio, maschera chirurgica, copertura per capelli, guanti chirurgici, un marcatore permanente non tossico, pinze e disinfettante. L’uso di abito chirurgico, guanti chirurgici usa e…

Representative Results

La figura 6 rappresenta uno schema di tutti i risultati di una procedura di biopsia che può essere adottata per standardizzare il protocollo e monitorare le prestazioni di ciascun operatore. Il principale risultato procedurale è la tempistica per completare la biopsia/biopsia; il principale risultato tecnico è la qualità della trama prodotta dopo i test genetici che potrebbero portare a una diagnosi conclusiva o inconcludente, quest’ultima delle quali ric…

Discussion

Solo gli embriologi esperti di esperti che hanno completato il loro periodo di formazione dovrebbero eseguire sia la biopsia TE che la vitrificazione della blastocisti. Inoltre, un testimone è tenuto a monitorare le procedure e garantire un’efficiente tracciabilità durante i) i movimenti della blastocisti biopsied dal piatto di biopsia ( Figura supplementare1) alla parabola post-biopsia (Figurasupplementare 1 ), quindi alla targhetta di vitrificazione (figura supplementare 1</s…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AG e RM hanno raccolto i dati e redatto il manoscritto. La DC analizzò i dati, redasse i risultati rappresentativi, eseguì le statistiche e rivedeva il manoscritto. FMU e LR hanno fornito una discussione critica dei risultati e dell’intero manoscritto.

Materials

Equipment
Cold tube rack Biocision XTPCR96
Electronic pipette controller Fisher Scientific 710931
Flexipet adjustable handle set Cook G18674 Stripper holder
Gilson Pipetman Gilson 66003 p20
IVF Electronic Witness System CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions RI Witness ART Management System
Inverted microscope Nikon Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood IVF TECH Grade A air flow
Laser objective RI Saturn 5
Microinjectors Nikon Narishige NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes Eppendorf CSLQSPIN for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope Leica Leica M80
Thermostat Panasonic MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator Panasonic MCO-5M-PE 02/CO2
Consumables
Biopsy pipette RI 7-71-30FB35720 30µm ID, flat 35°C
Cryolock Cryolock CL-R-CT
CSCM complete Irvine Scientific 90165 IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter Cook G17934
Flexipet pipette Cook G26712 140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette Cook G46020 300µm stripping pipette tips
Holding pipette RI 7-71-IH35/20 30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin Irvine Scientific 9988
IVF One well dish Falcon 353653
Mineral Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305
Modified HTF Medium Irvine Scientific 90126 Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface Thermofisher scientific 176740 IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish Corning 353802 60x15mm
Reproplate Kitazato 83016
Serological pipette Falcon 357551 10ml
Sterile disposable Gilson tips Eppendorf 0030 075.021 200µl
Tubing Kit Provided by the genetic lab PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media Kitazato VT801 Equilibration and vitrification solutions
Warming media Kitazato VT802 Thawing and dilution solutions

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Citer Cet Article
Maggiulli, R., Giancani, A., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human Blastocyst Biopsy and Vitrification. J. Vis. Exp. (149), e59625, doi:10.3791/59625 (2019).

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