Summary
우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석을 사용 하 여 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 mRNA 번역 조절을 연구 하기 위한 프로토콜을 제시 합니다. 분석 법은 5 '-미 번역 지역 (UTR) 및 3 '-UTR를 포함 하 여 mRNA의 cis요소에 의해 번역 조절을 연구 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 다른 변환 시작 모드를 검사할 수도 있습니다.
Abstract
바이러스 DNA 복제 후에 전사 된 모든 폭스 바이러스 mRNA는 5 '-UTR의 진화 적으로 보존 된 비 템플릿 기반 5 ' 폴 리 (A) 선두 주자입니다. 폭스 바이러스 감염 시 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 해 하는 우리는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 검정을 개발 했습니다. 이 리포터 검정은 4 개의 핵심 단계를 포함 한다: (1) 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 증폭 하는 PCR; (2) 시험관 내 전사 T7 RNA 중 합 효소를 사용 하 여 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 시험관 내에서 세포 내로 전사 된 mRNA를 도입 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출. 여기에 설명 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 플라스 미드 로부터 폭스 바이러스에 감염 된 세포 및 비밀 전사의 플라스 미드 복제의 문제를 회피 한다. 이 프로토콜은 폭스 바이러스에 감염 된 세포가 아닌 시스템에서 5 '-UTR 및 3 '-UTR를 포함 한 mRNA의 cis원소에의 한 번역 조절을 결정 하는데 사용 될 수 있다. 또한이 방법을 사용 하 여 cap 종속, cap 독립적, 다시 시작 및 내부 시작과 같은 다양 한 번역 시작 모드를 조사할 수 있습니다.
Introduction
중앙 교리에 따르면, 유전 정보는 DNA에서 RNA로 그리고 마침내 단백질1,2로 흐릅니다. 유전 정보의이 흐름은 mRNA 번역3을포함 하 여 많은 수준에서 높게 통제 됩니다,4. 유전자 발현 조절을 측정 하기 위한 리포터 분석의 개발은이 과정에 관여 하는 규제 메커니즘의 이해를 용이 하 게 한다. 여기서 우리는 폭스 바이러스에 감염 된 세포에서 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법을 사용 하 여 mRNA 번역을 연구 하는 프로토콜을 설명 한다.
폭스 바이러스는 많은 매우 위험한 인간과 동물 병원 균을 포함 한다5. 다른 모든 바이러스 처럼, 폭스 바이러스 독점적으로 단백질 합성에 대 한 호스트 세포 기계에 의존6,7,8. 바이러스 성 단백질을 효율적으로 합성 하기 위해 바이러스는 세포 중개 기계를 납치 하 여 바이러스 mrnas7,8의 번역을 위해이를 리디렉션하는 많은 전략을 진화 시켰습니다. 바이러스에 의해 일반적으로 채택 되는 기계 장치는 그들의 전사체에 있는 cis행동 요소를 사용 하는 것입니다. 주목할 만한 예로는 내부 리보솜 진입 부위 (에 어) 및 캡 독립적인 번역 증강 인자 (인용),11등이 있다. 이러한 cis요소는 다양 한 기 작12,13,14를 통해 중개 기계를 유치 함으로써 번역 적 우위를 바이러스 전사체를 렌더링 한다. 100 폭스 바이러스 mrnas는 5 ' 미 번역 지역 (UTR)에서 진화 하 여 보존 된 시스-작동 소자를가지고 있으며,이러한 mrnas15의 5 ' 말단에서 5 ' 폴 리 (a) 리더입니다. 이러한 5 '-폴 리 (A) 지도자의 길이는 이종 이며 전사 동안 폭스 바이러스 부호화 RNA 중 합 효소17,18의 미 끄 러 짐에 의해 생성 된다. 우리와 다른 사람들은 최근 5 '-폴 리 (A) 지도자가 백 시 니 아 바이러스 (vacv)에 감염 된 세포에서 mRNA에 번역 이점을 부여 한다는 것을 발견 하였으며,이는 폭스 바이러스19,20의 프로토 타입 부재 이다.
시험관 내 전사 된 RNA 계 루시퍼 라 제 리포터 분석은 처음에 폭스 바이러스 감염19,21동안 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 이해 하기 위하여 개발 되었다. 플라스 미드 DNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석 법이 널리 사용 되 고 있지만, 폭스 바이러스 감염 세포에서의 결과 해석을 복잡 하 게 하는 몇 가지 단점이 있다. 먼저, 플라스 미드는 VACV 감염 세포 (22)에서 복제할 수 있다. 둘째, 암호화 된 전사는 플라스 미드 DNA18,23,24에서 종종 발생 한다. 셋째, VACV 프로모터 구동 전사는 불균일 한 길이의 폴 리 (A) 리더를 생성 하 여 일부 실험18에서 폴 리 (a) 지시선 길이를 제어 하기 어렵게 한다. 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 이러한 문제를 회피 하 고 데이터 해석은 간단 합니다.
이 방법에는 4 가지 주요 단계가 있습니다. (1) 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 시험관 내 전사를 위한 DNA 템플릿을 생성 하는 단계; (2) 시험관 내 전사 mRNA를 생성 하는 단계; (3) 세포에 mRNA를 전달 하는 형질 전환; (4) 번역의 지표로 서의 루시퍼 라 제 활동의 검출 (그림 1) 얻어진 PCR 증폭은 5 ' ~ 3 ' 방향으로 다음과 같은 요소를 포함 합니다: T7, 폴 리 (a) 리더 또는 원하는 5 ' UTR 서 열, 반딧불 루시퍼 라 제 오픈 리딩 프레임 (ORF) 뒤에 폴 리 (a) 꼬리. PCR 증폭은 T7 중 합 효소를 사용 하 여 시험관 내 전사에 의해 mRNA를 합성 하는 템플릿으로 사용 된다. 시험관 내 전사 동안, m7G 캡 또는 다른 캡 아날로그는 새로 합성 된 mRNA에 혼 입 된다. 캡 핑 된 전사체는 감염 되지 않은 또는 VACV 감염 된 세포로 형질 전환 된다. 세포 파쇄 액은 형질 감염 후 원하는 시간에 수집 되어 mRNA 로부터 단백질 생산을 나타내는 루시퍼 라 제 활동을 측정 한다. 이 리포터 분석 법은 mRNA의 5 '-UTR, 3 '-UTR 또는 그밖 지구에 있는 cis원소 존재에 의해 번역 규칙을 공부 하기 위하여 이용 될 수 있습니다. 더욱이, 시험관 내 전사 된 RNA-기반 어 세이는 캡 의존적 개시, 캡 독립적 개시, 재 개시 및 아 스와 같은 내부 개시를 포함 하는 번역 개시의 상이한 메커니즘을 연구 하는데 사용 될 수 있다.
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Protocol
1. 시험관 내 전사 를 위한 PCR에의 한 DNA 템플릿 제조
- PCR에 의해 DNA 템플릿을 제조 하기 위해, 프라이 머를 설계 하였다. 프라이 머를 설계 할 때 뇌관 길이, 어 닐 링 온도 (Tm), GC 내용, G 또는 C 등으로 3 끝과 같은 중요 한 특성을 고려
참고: 이들 문헌25,26,27에서 상세히 논의 한다. - 다음 원소를 포함 하는 PCR 앰 플 아이콘을 생성 하는 프라이 머를 설계 하 여 5 ' 내지 3 ' 방향: T7, 폴 리 (A) 리더, 반딧불 루시퍼 라 제 ORF 및 폴 리 (A) 꼬리는 T7_12A로 서 지칭 된다. 디자인 프라이 머 (정방향 및 역방향)는 템플릿 DNA에 존재 하지 않는 모든 부가적인 원소 들을 포괄 한다 (도 2a).
참고: 모든 요소의 시퀀스는 표 1 에서 찾을 수 있습니다. - 앞으로 프라이 머 (5T7 ')28의 추가 뉴클레오티드를 포함 하 고, 상기 리포터 유전자의 5 ' 말단에 상응 하는, UTR 서 열 및 약 20 개 뉴클레오티드를 기준으로 하 여, tm에 기초 하 여 조정 된 다. Orf. 프라이 머에 상응 하는 영역이 유전자의 센스 가닥 (+ 가닥)과 동일한 지 확인 한다.
참고: 긴 5 '-UTR의 경우, 두 개의 DNA 단편을 합성 합니다: T7 프로모터를 가진 하나는 리포터 유전자의 ORF과 함께 긴 5 '-UTR 및 두 번째. 이 두 단편을 중첩 확장 PCR29를 사용 하 여 결합 합니다. - 폴 리 (A) 꼬리와 약 20 개의 뉴 클레 오타 이드를 포함 하는 역방향 프라이 머 (5M.3t)는 리포터 유전자의 ORF의 3 ' 말단에 상응 하는 Tm에 기초 하 여 조정 한다. 프라이 머에서 상응 하는 영역이 폴 리 (A) 꼬리에 존재 하는 유전자의 안티 센스 가닥 (가닥)과 동일한 인-프레임 정지 코 돈을 확인 한다.
참고: 폴 리 (A) 지시선 또는 폴 리 (A) 꼬리의 원하는 길이는 프라이 머에서 사용자 정의 할 수 있다. 예를 들어 폴 리 (A) 꼬리에 50 A를 추가 하려면 역방향 프라이 머가 50 T의 것을 수반 해야 합니다. 마찬가지로, 폴 리 (A) 리더에 20A의를 추가 하기 위해, 전방 프라이 머는 20 A의를 수반 한다. - 내부 제어를 위하여, 다음 원소 들을 5 ' 내지 3 ' 방향으로 포함 하는 또 다른 프라이 머 세트를 설계 한다: T7 프로모터, 코자크 서 열을 포함 하는 랜덤 한 5 '-UTR 코딩 서 열, 렌 딜 로 루시퍼 라 제 ORF 및 폴 리 (a) 꼬리는 하기에서 언급 되었다 T7_ 고 자크-루크.
- PCR 튜브에서 다음과 같은 순서로 시 약을 추가 합니다. DNase 자유 물, 2 배의 고 충실도 DNA 중 합 효소, 프라이 머 및 서 열 루시퍼 라 제 템플릿 DNA를 확인 하였다 (표 2).
참고: 혼합물 내의 개별 성분의 양은 반응 부피에 따라 조정 되어야 한다. - 표 3에 나타난 바와 같이 표준 3 단계 (변성, 어 닐 링, 연장) PCR 주기를 사용 하 여 DNA 템플릿을 생성 한다.
참고: 소 둔 온도 X ° c는 사용 되는 프라이 머 세트 및 연장 시간 T min에 의존 하 여 PCR 증폭 크기 및 사용 된 DNA 중 합 효소에 의존 한다. - Pcr 산물의 5-10%를 상업적으로 이용 가능한 분자량 표준에 따라 1% 아가 로스 트리 스 아세테이트 EDTA (태) 겔 전기 영동으로 실행 하 여 pcr 생성 물을 검출 한다. UV 조명 아래에서 겔을 시각화 하 여 PCR 산물의 크기를 결정 한다.
- PCR 산물의 정확한 크기를 결정 한 후에, T7_12A-Fluc 및 T7_Kozak에 대해 1.0 kb에 대해 ~ 1.7 kb, 시판 되는 PCR 정제 키트를 사용 하 여이를 정제 한다. 100 µ L 뉴 클레 아 제 자유 물을 사용 하 여 DNA를 용 수 (그림 2b).
- 일단 정제 되 면 분 광 광도 계를 이용 하 여 DNA의 농도를 확인 하 고 A260/A280 비율을 결정 한다 (~ 1.8-2.0은 허용 가능).
- 정제 된 DNA를-20°c에서 저장 하거나 즉시 시험관 내 전사에 사용 한다.
2. 시험관 내 전사에의 한 mRNA 생성
-
시험관 내에서 PCR 산물 로부터 RNA를 합성 하 고, 시험관 내 전사 키트를 사용 한다 (도 3a).
참고: T7_12A-fluc 및 T7_Kozak-RLUC DNA 템플릿은 각각 12a-Fluc 및 코자크 Rluc mRNAs를 합성 하는 데 사용 됩니다.- 이를 위해 마이크로 원심 분리기 튜브를가지고 다음과 같은 순서로 시 약을 추가 합니다. DNase-RNase가 없는 물, NTP 버퍼 믹스, 캡 아날로그, 템플릿 PCR 제품, T7-RNA 중 합 효소 혼합물 (표 4).
참고: 다른 캡 핑 시스템은 또한 제조자의 지시에 따라 시험관 내 전사 후에 RNA를 순차적으로 캡으로 사용할 수 있다. - 2 시간 동안 37 ° c에서 철저히 혼합 하 고 배양 하십시오.
- RNA 정제 키트를 이용 하 여 합성 된 RNA의 정제를 진행 한다.
- 이를 위해 마이크로 원심 분리기 튜브를가지고 다음과 같은 순서로 시 약을 추가 합니다. DNase-RNase가 없는 물, NTP 버퍼 믹스, 캡 아날로그, 템플릿 PCR 제품, T7-RNA 중 합 효소 혼합물 (표 4).
- 정제 된 RNA를 1.5%의 스 트리 보 레이트-EDTA (TBE) 젤 (0.5 µ)으로 실행 하 여 RNA를 확인 하였다. UV 조명 아래에서 젤을 시각화 합니다 (그림 3b).
- 분 광 광도 계를 이용 하 여 RNA의 농도를 확인 하 고 A260/A280 비율 (~ 1.8-2.0은 허용 가능)을 확인 한다.
- 정제 된 RNA를 분 취 하 고-80 ° c에서 저장 한다.
3. 세포에 형질 주입 mRNA
- 24 웰 플레이트에 있는 종자 헬 라 세포 (약 ~ 80-90%의 콘 유창 다음 날) 및 5% CO2로 37 ° c에서 인큐베이터에서 밤새 배양 한다.
- 감염의 다중성에 (VACV) 백 시 니 아 바이러스로 헬 라 세포를 감염 (MOI) 5 또는 비교를 위한 감염 되지 않은 헬 라 세포를 유지.
참고: MOI는 세포 당 전염 성 바이러스 입자의 수입니다. - X의 모이 (세포 수 * X)/바이러스 역가 1000} µ 바이러스의 1 mL 배지 당.
-
바람직한 h 사후 감염 (hpi) (10-12 hpi에서 본 실험에서), 도 3c에 도시 된 바와 같이 양이온 성 지질 형질 감염 시 약을 사용 하 여 형질 주입 mrna (24 웰 플레이트의 웰 당 총 mrna의 500 ng).
- 24 웰 플레이트의 웰에 대해서는, 1 개의 마이크로 원심 분리기 튜브에 루시퍼 라 제의 12A 시퀀스 베어링 반딧불이 및 20 ng의 코자크 서 열 베어링 Renilla 루시퍼 라 제 (kozak-rluc) mrna를 혼합 480 ng. 또 다른 마이크로 원심 분리기 튜브에는 양이온 성 지질 형질 감염 시 약의 1.1 µ L을 추가 합니다.
- 두 튜브에 55 µ L의 감소 된 혈 청 배지를 추가 합니다. 상 온에서 5 분간 혼합 하 여 배양 한다.
- 인큐베이션의 5 분 후에, 55 µ L 양이온 성 지질 형질 감염 시 약을 포함 하는 mRNA에서 감소 된 혈 청 배지를 함유 하는 튜브를 첨가 한다.
- 부드럽게 하지만 철저히 혼합 하 고 실 온에서 15 분간 배양 합니다.
- 배양 동안, 세포 배양 액을 제거 하 고 24 웰 플레이트의 웰 당 감소 된 혈 청 배지를 400 µ L을 첨가 한다.
- 배양 후, 혼합물의 100 µ L을 24 웰 플레이트의 웰에 고르게가 하 여 첨가 한다.
4. 루시퍼 라 제 활동 측정
- 5 시간 후 12A-Fluc 및 Kozak-Rluc mRNA의 공동 형질 전환-2 개의 리포터 분석 (예컨대, 이중 루시퍼 라 제 리포터 분석 키트)을 수행할 수 있는 루시퍼 라 제 분석 시스템을 사용 하 여 루시퍼 라 제 활성을 측정 한다.
- 감소 된 혈 청 배지를 제거 하 고 150 µ L 1x 용 해 완충 액을 추가 하 여 세포를 lyse, 루시퍼 라 제 분석 키트의 구성 요소.
- 실 온에서 10 분간 인큐베이션 한 후, 세포를 스크 래핑 하 여 파쇄 물을 수집 하 고 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
- 파쇄 물을 12000 x g 에서 4°c에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛 세포 파편으로 한다.
- 고체 바닥으로 불투명 벽 96 잘 흰색 분석 판에 상층 액의 30 µ L을 추가 합니다.
- 루시퍼 라 제 분석 키트 및 다중 모드 플레이트 리더 루미 노 미터를 사용 하 여 이중 발광을 측정 하십시오.
- 표 5에 설명 된 설정을 사용 하 여 역학 기능 (well 기준)을 사용 하 여 측정을 수행 합니다.
참고: 독서는 또한 수동 루미 노 미터를 사용 하 여 촬영 할 수 있습니다. 큐 벳에 Fluc에 대 한 용 해물과 기질을 동량 추가 합니다. 2 초 동안 기다렸다가 루미 노 미터를 사용 하 여 10 초 동안 측정 합니다. Fluc 측정에 따라 루미 노 미터에서 큐 벳을 빠르게 꺼내 수동으로 Rluc 용 기판의 동량을 추가 합니다. 다시, 2 s를 기다린 루미 노 미터를 사용 하 여 10 s에 대 한 측정 합니다. - 형광 판독 데이터를 바람직한 파일 형식으로 내보냅니다.
- 내부 대조 Rluc 값에 의해 Fluc 값을 분할 하 여 감염 되지 않은 및 VACV 감염 된 헬 라 세포에서 12A-Fluc mRNA 로부터 상대적인 번역 속도를 결정 한다.
참고: 보충 그림 1 은 상대적인 fluc 활동을 얻기 위해 원시 데이터의 단계별 분석을 보여줍니다.
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Representative Results
시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 4 단계: 시험관 내 기록 체에 대 한 DNA 템플릿 생성 PCR, mRNA 트랜스 펙 션 및 루시퍼 라 제 측정을 생성 하는 생체 외 전사, 개략도에서 볼 수 있다 ( 그림 1). DNA 템플릿 (Fluc 및 Rluc) 모두를 위한 프라이 머의 설계 및 오버행 확장 PCR의 일반적인 계획은 도식 적으로 예시 된다 (도 2a). PCR 후, 정확한 크기의 PCR 산물을 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 검출 하였다 (도 2b). 이어서, PCR 산물은 시험관 내에서 RNA를 합성 하는 템플릿으로 서 사용 된다 (도 3a),이는 정제 되 고 tbe 겔 전기 영동으로 실행 되어 크기를 확인 한다 (도 3b). 정제 되 고 검증 된 mRNA는 양이온 성 지질 형질 감염 시 약을 사용 하 여 세포로 형질 감염 된다 (도 3c). 이 프로토콜에 사용 되는 프라이 머는 표 6에 나열 되어 있다.
시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 폭스 바이러스 감염 시 mRNA 번역에서 5 '-폴 리 (A) 지도자의 역할을 이해 하기 위하여 개발 되었다. 이 분석 법을 사용 하 여, 우리는 감염 되지 않고 VACV 감염 된 세포에서 5 ' 폴 리 (A) 지도자 (12nt)를 포함 하는 Fluc mRNA의 번역 효율성을 시험 했습니다. Fluc 값은 비 감염 및 VACV 감염 세포 모두에서 Rluc 값을 사용 하 여 정규화 되어 상대적인 Fluc 활성 (즉, Fluc 활성/Rluc 활성)을 결정 한다 (도 4a). Rluc에의 한 Fluc의 분열은 특정 웰에서 형질 전환 효율 및 RNA 안정성을 정상화 시켰다. 이러한 분석 접근법을 이용 하 여, 우리는 mRNA를 포함 하는 5 '-폴 리 (A) 리더가 VACV 감염 동안 번역 적 이점을가지고 있다고 판단 하였다 (도 4b). 감염 된 세포에서의 이점은 RNA 수준으로 서의 형질 전환 효율 또는 mRNA 안정성에 기인 하지 않은 감염 및 VACV 감염 세포에서 5 h 포스트 mRNA 트랜스 펙 션19에 기인한 것 이었다.
그림 1: 실험 절차의 개략도. PCR은 원하는 원소를 갖는 DNA 템플릿을 생성 하는데 사용 된다. 루시퍼 라 제 리포터 유전자를 코딩 하는 mRNA는 T7 RNA 중 합 효소 기반 시스템을 사용 하 여 시험관 내에서 합성 된다. 반딧불 루시퍼 라 제 (Fluc) mRNA는 감염 되지 않은 또는 VACV 감염 된 세포로의 Renilla 루시퍼 라 제 (Rluc) mRNA로 공동 형질 전환 된다. 루시퍼 라 제 활동은 이중 루시퍼 라 제 기능을 갖춘 루미 노 미터를 사용 하 여 측정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 프라이 머 설계 및 PCR 기반 DNA 증폭 (A) 상기 정방향 프라이 머는 8nt 랜덤 서 열을 포함 하 고, T7 프로모터는 루시퍼 라 제 리포터 유전자의 5 ' 말단의 UTR 및 일부를 원하는 반면, 역방향 프라이 머에는 폴 리 (A) 꼬리와 3 ' 말단을 생성 하는 T-소책자를 포함 하 고 루시퍼 라 제 리포터 유전자. 루시퍼 라 제 유전자를 포함 하는 플라스 미드 템플릿을 이용한 오버행 확장 PCR에 의해, DNA 템플릿이 생성 된다. (B) PCR 반응 으로부터 원하는 크기의 DNA 밴드를 1% 아가 로스 태 겔 전기 영동을 이용 하 여 검출 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 3: mRNA 합성 및 형질 감염. (A) 시험관 내 전사의 개략도. UTR의 루시퍼 라 제 유전자를 포함 하는 PCR에 의해 증폭 된 DNA 및 T7 프로모터는이를 템플릿으로 사용 한다. T7 RNA 중 합 효소는 프로모터에 모집 되며 5 '에서 3 ' 방향으로 흰색으로 표시 된 리 보 뉴클레오티드를 추가 합니다. MRNA가 25-30 nt 긴 경우에, m7g모자는 반대로 반전 모자 아날로그, ARCA를 사용 하 여 추가 됩니다. (B) 시험관 내 전사 웨어 로부터 RNA 밴드는 1.5%의 아가 로스 tbe 겔 전기 영동을 사용 하 여 검출 하였다. (C) 리포터 mRNA를 세포 내로 형질 감염 시키는 것을 입증 하는 개략도. 리포터 mRNA 또는 양이온 성 지질 형질 감염 시 약을 별개의 관에 포함 하는 배지는 상 온에서 5 분간 평형 화를 허용 한다. 용액을 이어서 혼합 한 후 15 분 동안 실 온에서 인큐베이션 하 여 RNA/형질 전환 시 약 혼합물을 배양 플레이트의 세포에 첨가 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 4:5 '-폴 리 (a) 리더를 포함 하는 mRNA의 번역 효율이 증가 하였다. (A) UTR와 Rluc mrna의 5 '-UTR에 있는 폴 리 (a) 선두 주자를 포함 하는 Fluc mrna를 5 '에서 코 아크 컨센서스 서 열과 함께 세포로 공동 형질 감염 시켰다. (B) 상기 5 '-폴 리 (A) 리더를 사용한 Fluc mrna는 감염 되지 않은 및 vacv 감염 세포에서 Rluc mrna와 함께 트랜스 펙 팅 되었다. 5 hpi, 루시퍼 라 제 활성을 루미 노 미터를 이용 하 여 측정 하였다. Rluc 정규화 된 Fluc 활성은 감염 되지 않은 및 VACV 감염 된 세포에서 나타난다. 오차 막대는 최소 3 개의 반복의 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. P-값을 결정 하기 위해 학생의 t-검정을 사용 했습니다. P-값 < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 요소 | 시퀀스 |
| T7 프로모터 | 타 카 다 |
| 폴 리 (A) 리더 | 3 ~ 51에 이르는 범위에서 |
| 코자크 서 열 | GCCACC |
| 폴 리 (A) 테일 | 이 경우에는이에 해당 하는 것입니다. |
표 1: 방법에 사용 되는 서 열-표는 T7 프로모터, 폴 리 (A) 리더, 코자크 서 열, 폴 리 (A) 꼬리의 서 열을 포함 한다.
| 구성 요소 | 볼륨 |
| DNase 무료 물: | 38 µ L |
| 2 배 높은 충실도의 DNA 중 합 효소 마스터 믹스: | 50 µ L |
| 포워드 프라이 머 (10 µ): | 4 µ l |
| 역방향 프라이 머 (10 µ): | 4 µ l |
| 루시퍼 라 제 DNA 템플릿 (1-10 ng/µ L): | 4 µ l |
| 총: | 100 µ L |
| Fluc DNA 템플릿에 대 한 공급원은 pGL3-Fluc 플라스 미드 | |
| Rluc DNA 템플릿에 대 한 소스는 Prlrluc 플라스 미드입니다 |
표 2: pcr 반응은pcr 반응에서 첨가 된 성분의 순서 및 부피.
| 단계 | 온도 | 시간 | 주기 |
| 초기 변성 | 95 ° c | 2 분 | (1x 사이클) |
| 변성 | 95 ° c: | 15 초 | |
| 어 닐 링 | X ° C: | 30 초 | (25 배 주기) |
| 확장 | 72 ° c: | T 민 | |
| 최종 확장 | 72 ° c: | 7 분 | (1x 사이클) |
| 개최 | 4°c: | ∞ |
표 3: PCR 프로그램-온도, 시간 및 주기와 함께 PCR 프로그램을 위한 단계.
| 구성 요소 | 볼륨 | |
| DNase-RNase 무료 물: | 최대 20 µ L | |
| NTP 버퍼 믹스 (각 rNTP의 20 mM): | 2 µ L | |
| 캡 아날로그 (40): | 4 µ L | |
| 템플릿 PCR 생성물 (400 ng) *: | X µ l | (PCR 산물 농도에 따라 다름) |
| T7-RNA 중 합 효소 혼합: | 2 µ L | |
| 총: | 20 µ L | |
| * T7_12A-Fluc 및 T7_Kozak-Rluc mRNA는 각각 12a-Fluc 및 코자크-루크를 합성 하는 데 사용 됩니다. |
표 4: 시험관 내 전사 반응 – 체 외 전사 반응에 첨가 되는 성분의 순서 및 부피.
| 단계 | 볼륨/시간 |
| 주입 루시퍼 라 제 분석 기질 (Fluc): | 30 µ L |
| 대기/배양 시간: | 2 초 |
| 형광 측정 (Fluc): | 10 초 |
| Glo 기판 (Rluc) & 중지: | 30 µ L |
| 대기/배양 시간: | 2 초 |
| 형광 측정 (Rluc): | 10 초 |
표 5: 루시퍼 라 제 측정 설정 – 권장 량 또는 시간을 루시퍼 라 제 측정 하는 단계.
| 뇌관 | 시퀀스 |
| T7-전방 | 이에 대 한 모든 것이 있습니다. (영문) 이은은 하, ... |
| -T7-유체 역방향 | TTTTTTTTTTTTTTTCTTCCGC에 대 한 |
| T7-고 락-루크 앞 | 라이에 스 트 라이에이 티 카 에 스 카 타가 |
| T7-코자크-루크 리버스 | TTTTTTTTTTCATTTTTTT 티 트 트 트 ttttttttt 이은 |
표 6: 프라이 머-이 방법에 사용 된 프라이 머는 완전 한 서 열을가지고 있다.
보조 그림 1: 원시 데이터 분석 – 원시 데이터를 분석 하 여 정규화 된 데이터를 가져오는 단계입니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
모든 4-코어 단계는 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석의 성공에 매우 중요 합니다. 특히 T7 프로모터 서 열에 대 한 프라이 머 디자인에 특별 한 주의가 주어져야 한다. T7 RNA 중 합 효소는 T7 프로모터의 밑줄이 그어진 첫 번째 G (gGG-5'-UTR) 로부터 전사를 시작 하 여 5 ' UTR 서 열 전에 첨가 하였다. 전사 개시 사이트 (TSS)는 5 ' 말단에서 제 1 G 로부터 시작 하지만, T7 프로모터 영역에서의 G의 3 미만의 수를 감소 시키면 RNA를 시험관 내 전사에서 수율/산출 하였다. 실험 동안, 우리는 젤 정제 된 DNA 생성물이 수율과 RNA의 질이 더 낮 았 기 때문에 시험관 내 전사에 대 한 최고가 아니었다는 것을 관찰 했습니다. 우리는 1% 아가 로스 겔 전기 영동에서 PCR 반응의 5-10%만을 실행 하 여 나머지 90-95%를 정제 하 고, PCR 정제 키트를 사용 하 여, 시험관 내 전사에 사용 될 수 있다. PCR 로부터 비 특이 적 증폭의 경우, 겔에서 원하는 크기의 밴드를 절단 하 고 겔 정제 된 DNA 단편을 사용 하는 것이 권장 된다. 수율은 낮을 수 있으므로, 시험관 내 전사 반응에 대 한 반응 부피를 증가 시키는 것이 좋습니다. 다른 형질 감염 기반 방법과 유사 하 게, DNA/RNA는 전 세계적으로 또는 선택적으로 번역을 억제할 수 있는 DNA/RNA 감지 통로를 자극할 수 있다. 따라서 실험에서이 문제로 인해 발생할 수 있는 문제가 발생 하지는 않았지만 데이터를 주의 해 서 해석 해야 합니다.
제안 된 방법은 mRNA 전달의 방법, 사용 되는 내부 대조 군, 번역을 위한 적당 한 시간, 표본 준비 및 자료의 분석 같이 몇몇 수정으로 다른 모형 시스템에서 사용 하기에 적당 합니다. 이 방법의 주된 제한은 생리 적 조건을 완전히 반영 하지 않는 cis 원소에의 한 번역 조절을 신속 하 게 테스트 하기 위한 리포터 분석입니다. 따라서,이 방법은 가능한 경우 다른 상보성 실험에 의해 확증 되어야 한다.
DNA 변형과 비교 하 여 RNA 변형의 역할은 덜 잘 이해 됩니다. 그러나RNA 수정30,31,32,33,34,35를 쓰고 읽고 지우는 효소의 발견으로 이제 영향을 연구할 수 있습니다. 유전자 발현 시의 RNA개 질30,31,32,33,34,35. 시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 rna 번역에 대 한 그들의 효과를 테스트 하기 위해 다른 RNA 변형을 통합 하 고 사용 하도록 변형 될 수 있다. 예를 들어,이 방법은 다양 한 변형30,31을 가지는 상이한 캡 유사 체를 통합할 수 있다. 추가적으로, 시험관 내 전사 중 또는 후에 내부 RNA 변성 효소를 보충 하는 것은 아마도 내부 RNA 변형을 통합할 수 있다. 캡 (0), 캡 (1) 및 내부 RNA 개 질에 대 한 개 질을 첨가 하 여 번역 된 이러한 RNA 변형의 역할을 연구 하는 도구를 제공할 것 이다.
시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석은 RNA 번역에 대 한 기본적인 생물학을 이해 하는데 큰 잠재력과 광범위 한 응용을가지고 있습니다. 이 방법을 사용 하 여 캡 의존 개시, 캡 독립적 개시, 재 개시 및 인 레 등의 내부 개시를 포함 하는 번역의 개시를 위한 상이한 메커니즘을 연구할 수 있다. 이러한 장점 들 위에,이 분석은 mRNA에 있는 5 '-UTR 및 3 '-UTR에서 cis원소에의 한 번역 조절을 시험 하기 위하여 채택 될 수 있습니다. 설명 된 프로토콜은 PCR 산물을 사용 하며,이는 긴 복제를 피하고 번역에 대 한 RNA 원소의 효과를 신속 하 게 검사할 수 있는 이점을 제공 합니다. PCR 중 잠재적 오류를 최소화 하기 위해 고 충실도 중 합 효소 및 낮은 PCR 주기 번호를 사용 해야 합니다. 대안적으로, 템플릿이 빈번 하 게 사용 된다면, 원하는 5-' UTR 및 루시퍼 라 제 ORF은 시험관 내 전사의 템플릿으로 서 플라스 미드 내로 클로닝 될 수 있다. 함께, 프로토콜은 단일 반응에서 전사 및 mRNA 캡 핑을 통합 하 고 시험관 내 전사 된 RNA 기반 루시퍼 라 제 리포터 분석을 사용자 친화적이 고, 빠르고, 직접적인 방법으로 만드는 종래의 형질 감염 및 해석을 활용 mRNA 번역의 기계 장치를 공부 하기 위하여.
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Disclosures
저자는 경쟁 금융 이익을 선언 하 고 싶습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 지 부 및 존슨 암 연구 센터 (http://cancer.k-state.edu)에 의해 부분적으로 PD에 대학원 학생 여름 급여의 형태로 건강의 국립 연구소 (AI128406 www.nih.gov)에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X-Q5 Master mix | New England Biolabs | M0492 | High-Fidelity DNA Polymerase used in PCR |
| 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog | New England Biolabs | S1411L | Anti reverse Cap analog or ARCA |
| Corning 96 Well Half-Area white flat bottom polystyrene microplate | Corning | 3693 | Opaque walled 96 well white plate with solid bottom |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1960 | Dual-Luciferase Assay Kit (DLAK) |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit | OMEGA BIO-TEK | D6492 | PCR purification kit |
| GloMax Navigator Microplate Luminometer | Promega | GM2010 | Referred as multimode plate reader luminometer |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA synthesis Kit | New England Biolabs | E2050S | In Vitro transcription kit |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Cationic lipid transfection reagent |
| NanoDrop2000 | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Used to measure DNA and RNA concentration |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Reduced serum media |
| Purelink RNA Mini Kit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | RNA purification kit |
| Vaccinia Capping System | New England Biolabs | M2080 | Capping system |
References
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