该协议使用基于探针的实时聚合酶链反应(PCR)、磺胺胺B(SRB)测定、3’未翻译区域(3’UTR)克隆和荧光素酶测定来验证感兴趣的miRNA的目标基因,并了解miRNA的功能。
微RNA (miRNA) 是小型调节RNA,可识别调节包括癌症在内的多种疾病中的许多细胞内信号通路。这些小型调节RNA主要与其目标信使RNA(mRNA)的3’未翻译区域(3’UTR)相互作用,最终导致mRNA解码过程的抑制和目标mRNA降解的增强。基于表达水平和细胞内功能,miRNA能够作为致癌和肿瘤抑制性mRNA的调节因子。在数百甚至数千个计算预测目标中识别 miRNA 的真正目标基因是识别感兴趣的 miRNA 的作用和基本分子机制的关键步骤。各种miRNA目标预测程序可用于搜索可能的miRNA-mRNA相互作用。然而,最具挑战性的问题是如何验证感兴趣的miRNA的直接靶基因。该协议描述了如何识别与miRNA功能相关的miRNA靶点的关键方法的可重复策略。该协议提供了一个实用的指南,用于使用基于探针的实时聚合酶链反应(PCR)、磺胺B(SRB)测定,在miRNA模拟转染后发现miRNA水平、功能和相关目标mRNA。,剂量反应曲线生成,和荧光素酶测定以及基因的3’UTR克隆,这是正确理解单个miRNA的作用所必需的。
微RNA(miRNA)是一种小型调节RNA,主要通过对真实靶基因1中的3’未翻译区域(3’UTR)做出反应来调节信使RNA(mRNA)的转换和降解过程。miRNA的表达可以通过转录和转录后机制调节。这种调节机制的不平衡导致包括癌症在内的众多疾病中不受控制和独特的miRNA表达水平。单个 miRNA 可以与不同的 mRNA 进行多种交互。相应地,单个 mRNA 可以由各种 miRNA 控制。因此,细胞内信号网络受到明显表达的miRNA的复杂影响,通过这种影响,生理疾病和疾病可以启动和恶化2,3,45,6.虽然在各种癌症中观察到了miRNA的改变表达,但调节癌细胞与miRNA一起进行的分子机制在很大程度上仍不为人所知。
累积的证据表明,miRNA的致癌或肿瘤抑制作用取决于癌症的类型。例如,通过瞄准叉头盒o3(FOXO3),miR-155促进结肠直肠癌7、8的细胞增殖、转移和化学抗药性。相比之下,胶质瘤细胞入侵的限制性是由miR-107通过神经原位位同源蛋白2(NOTCH2)表达9的调节引起的。评估miRNA-目标相互作用与miRNA功能是一个不可或缺的部分,更好地了解miRNA如何调节各种生物过程在健康和疾病状态10。此外,miRNA真正靶点的发现,可以进一步为基于miRNA的抗癌药物治疗提供微调的策略。然而,miRNA领域的主要挑战是确定miRNA的直接目标。在这里,详细的方法作为可重复的实验方法,用于miRNA靶基因的测定。miRNA目标鉴定的成功实验设计涉及各种步骤和注意事项(图1)。比较肿瘤细胞和正常细胞中的成熟miRNA水平是选择感兴趣的miRNA的常见程序之一(图1A)。对选定的miRNA进行功能研究,以检测miRNA对细胞增殖的影响,对于缩小感兴趣的miRNA最佳潜在候选靶点列表非常重要(图1B)。基于miRNA的实验验证功能,需要用miRNA靶向预测程序对公司文献和数据库进行系统审查,以搜索与基因功能最相关的信息(图1C)。通过实施荧光素酶测定以及基因3’UTR的克隆、实时PCR和西方印迹(图1D),可以识别感兴趣的miRNA的真实目标基因。当前协议的目标是提供关键实验、基于探针的实时聚合酶链反应 (PCR)、磺胺 B (SRB) 分析后 miRNA 模拟转染、剂量-反应曲线生成以及荧光酶测定以及基因3’UTR的克隆。目前的协议对于更好地了解单个 miRNA 的功能以及 miRNA 在癌症治疗中的含义非常有用。
确定具有目标miRNA功能的真正miRNA靶点的策略对于理解miRNA的多重作用是必不可少的。miRNA靶基因的识别可以作为解释由miRNA在细胞中调节的细胞信号事件的指南。揭示miRNA的功能重要的靶基因可以为开发基于miRNA的癌症治疗提供基本知识。
微阵列、小RNA库测序、深度测序、原位PCR逆转录酶和北方印迹等多种方法,利用从细胞系和组织中分离出的总RNA,可用于探索m…
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了韩国国家科学研究基金会(NRF)基础科学研究计划的支持,该基金会由韩国教育部资助(2017R1D1A3B03035662);和Hallym大学研究基金,2017年(HRF-201703-003)。
15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
6-well plate | Falcon | 353046 | |
6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
96-well plate | Falcon | 353072 | |
Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
Shaker | TECAN | Shaking platform | |
Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |