ट्यूमर कोशिकाओं में MicroRNA स्तर, कार्यों, और एसोसिएटेड लक्ष्य जीन का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विट्रो प्रोटोकॉल
Summary
इस प्रोटोकॉल एक जांच आधारित वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), एक sulforhodamine बी (एसआरबी) परख, 3′ untranslated क्षेत्रों (3′ UTR) क्लोनिंग का उपयोग करता है, और एक luciferase परख ब्याज की एक miRNA के लक्ष्य जीन को सत्यापित करने के लिए और mirnas के कार्यों को समझने के लिए.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) छोटे नियामक आरएनए जो कैंसर सहित कई रोगों में कई intracellular संकेतन रास्ते मोड्यूल करने के लिए मान्यता प्राप्त कर रहे हैं. इन छोटे विनियामक आरएनए मुख्य रूप से अपने लक्ष्य दूत आरएनए (एमआरएनए) के 3′ untranslated क्षेत्रों (3′ UTR) के साथ बातचीत अंततः MRNAs की डिकोडिंग प्रक्रियाओं के अवरोध और लक्ष्य MRNA अवक्रमण के संवर्धन में जिसके परिणामस्वरूप. अभिव्यक्ति के स्तर और intracellular कार्यों के आधार पर, miRNAs oncogenic और ट्यूमर-suppressive mRNAs के नियामक कारकों के रूप में सेवा करने में सक्षम हैं. सैकड़ों या यहां तक कि गणना की भविष्यवाणी लक्ष्य के हजारों के बीच एक miRNA के सदाशयी लक्ष्य जीन की पहचान भूमिकाओं और ब्याज की एक miRNA के बुनियादी आणविक तंत्र विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. विभिन्न miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी कार्यक्रम संभव miRNA-mrNA बातचीत खोज करने के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, सबसे चुनौतीपूर्ण सवाल यह है कि कैसे ब्याज की एक miRNA के प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन को मान्य करने के लिए. यह प्रोटोकॉल miRNA के कार्य से संबंधित miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के तरीके पर महत्वपूर्ण विधियों की एक पुन: उत्पादनीय रणनीति का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल जांच आधारित वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), sulforhodamine बी (एसआरबी) एक miRNA नकल transfection के बाद का उपयोग कर miRNA स्तर, कार्यों, और संबंधित लक्ष्य mRNAs को उजागर करने के लिए कदम दर कदम प्रक्रियाओं पर एक व्यावहारिक गाइड प्रस्तुत करता है , खुराक प्रतिक्रिया वक्र पीढ़ी, और luciferase परख एक जीन के 3 ‘ UTR की क्लोनिंग के साथ, जो व्यक्तिगत miRNAs की भूमिकाओं की उचित समझ के लिए आवश्यक है.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) छोटे नियामक RNAs है कि मुख्य रूप से अनुवाद और दूत RNAs (mRNAs) की गिरावट की प्रक्रिया को संजोना कर रहे हैं 3′ untranslated क्षेत्रों (3′ UTR) सदाशयी लक्ष्य जीन1में प्रतिक्रिया द्वारा. miRNAs की अभिव्यक्ति प्रतिलेखन और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल तंत्र द्वारा विनियमित किया जा सकता है। इस तरह के विनियामक तंत्रों के असंतुलन से कैंसर2सहित अनेक रोगों में अनियंत्रित और विशिष्ट मिराना अभिव्यक्ति का स्तर उत्पन्न होता है . एक एकल miRNA विविध mRNAs के साथ कई बातचीत हो सकती है. संगत, एक व्यक्ति MRNA विभिन्न mirnaद्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. अतः इंट्रासेल्यूलर संकेतन नेटवर्क विशिष्ट रूप से व्यक्त मिराना से जटिल रूप से प्रभावित होते हैं जिसके द्वारा शारीरिक विकारों और रोगों को आरंभ किया जा सकता है और2,3,4, 5 , 6.यद्यपि मिरानए की परिवर्तित अभिव्यक्ति विभिन्न प्रकार के कैंसरों में देखी गई है, फिर भी मिर्नेस के साथ संयोजन के रूप में कैंसर कोशिकाओं के शिष्टाचार को परिवर्तित करने वाले आणविक तंत्र अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं।
एकत्र सबूत दिखा रहा है कि miRNAs के oncogenic या ट्यूमर-संपीड़ित भूमिकाओं कैंसर के प्रकार पर निर्भर करते हैं. उदाहरण के लिए, फोर्कहेड बॉक्स ओ 3 (FOXO3) को लक्षित करके, miR-155 कोशिका प्रसार,मेटास्टेसिस, और कोलोरेक्टल कैंसर 7,8के chemoresistance को बढ़ावा देता है। इसके विपरीत, ग्लियोमा सेल आक्रमण के प्रतिबंध neurogenic टिड्डी पायदान homolog प्रोटीन 2 (NOTCH2) अभिव्यक्ति9के विनियमन के माध्यम से miR-107 द्वारा प्रेरित है। miRNA कार्यों के संबंध में miRNA-लक्ष्य बातचीत का मूल्यांकन बेहतर समझने के लिए एक अनिवार्य हिस्सा है कि कैसे miRNAs दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों में विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित10. इसके अलावा, miRNAs के सदाशयी लक्ष्य (ओं) की खोज आगे विभिन्न विरोधी कैंसर दवाओं के साथ एक miRNA आधारित चिकित्सा के लिए एक ठीक tuned रणनीति प्रदान कर सकते हैं. तथापि, मिरानए के क्षेत्र में मुख्य चुनौती मिरानए के प्रत्यक्ष लक्ष्यों की पहचान है। यहाँ, विस्तृत तरीकों miRNA लक्ष्य जीन निर्धारण के लिए reproduible प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. मिर्ना लक्ष्य पहचान के लिए सफल प्रायोगिक डिजाइन में विभिन्न चरण और विचार शामिल हैं (चित्र 1)। ट्यूमर कोशिकाओं और सामान्य कोशिकाओं में परिपक्व miRNA स्तर की तुलना ब्याज की एक miRNA का चयन करने के लिए आम प्रक्रियाओं में से एक हो सकता है (चित्र 1A) . सेल प्रसार पर एक miRNA के प्रभाव का पता लगाने के लिए एक चयनित miRNA के कार्यात्मक अध्ययन के लिए ब्याज की एक miRNA के सर्वश्रेष्ठ संभावित उम्मीदवार लक्ष्यों की सूची को संकीर्ण करने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्र 1B) . miRNAs के प्रायोगिक रूप से मान्य कार्यों के आधार पर, एक miRNA लक्ष्य भविष्यवाणी कार्यक्रम के साथ कंपनी में साहित्य और डेटाबेस की एक व्यवस्थित समीक्षा जीन कार्यों पर सबसे अधिक प्रासंगिक जानकारी खोज करने के लिए आवश्यक है (चित्र 1C)। ब्याज की एक miRNA के वास्तविक लक्ष्य जीन की पहचान इस तरह के एक जीन की 3 ‘UTR की क्लोनिंग के साथ luciferase परख के रूप में प्रयोगों को लागू करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, वास्तविक समय पीसीआर, और पश्चिमी सोख्ता (चित्र 1D)। वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य प्रमुख प्रयोगों के व्यापक तरीकों प्रदान करने के लिए है, जांच आधारित वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर), sulforhodamine बी (एसआरबी) परख एक miRNA नकल transfection के बाद, खुराक प्रतिक्रिया वक्र पीढ़ी, और एक जीन के 3 ‘ UTR की क्लोनिंग के साथ luciferase परख. वर्तमान प्रोटोकॉल व्यक्तिगत miRNAs के कार्यों की एक बेहतर समझ और कैंसर चिकित्सा में एक miRNA के निहितार्थ के लिए उपयोगी हो सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ब्याज की एक miRNA के कार्यों के साथ सदाशयी miRNA लक्ष्यों के निर्धारण के लिए रणनीतियाँ miRNAs की कई भूमिकाओं की समझ के लिए अपरिहार्य हैं. miRNA लक्ष्य जीन की पहचान एक सेल में miRNAs द्वारा संग्राहक सेल संकेतन घटनाओं की व्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (एनआरएफ) शिक्षा मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित के माध्यम से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (2017R1D1A3B03035662); और हालिम विश्वविद्यालय अनुसंधान कोष, 2017 (एचआरएफ-201703-003)।
Materials
| 15 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| 50 mL conical tube | SPL Life Sciences | 50050 | |
| 6-well plate | Falcon | 353046 | |
| 6X DNA loading dye | Real Biotech Corporation | RD006 | 1 mL |
| 8-cap strip | Applied Biosystems | N8010535 | For cDNA synthesis |
| 8-tube strip | Applied Biosystems | N8010580 | For cDNA synthesis |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Acetic acid | Sigma | A6283-1L | 1 L |
| Agarose A | Bio Basic | D0012 | 500 g |
| Alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0290S | 10,000 U/mL |
| Ampicillin | Bio basic Canada Inc | AB0028 | 25 g |
| AriaMx 96 tube strips | Agilent Technologies | 401493 | For real time PCR |
| AriaMx real-time PCR system | Agilent Technologies | G8830A | qPCR amplification, detection, and data analysis |
| AsiSI | New England Biolabs | R0630 | 10,000 units/mL |
| CAPAN-1 cells | ATCC | HTB-79 | |
| Cell culture hood | Labtech | Model: LCB-1203B-A2 | |
| Counting chambers with V-slash | Paul Marienfeld | 650010 | Cells counter |
| CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | 10X concentration |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | 500 mL |
| DNA gel extraction kit | Bionics | DN30200 | 200 prep |
| DNA ladder | NIPPON Genetics EUROPE | MWD1 | 1 Kb ladder |
| DNase I | Invitrogen | 18068015 | 100 units |
| Dual-luciferase reporter assay system | Promega | E1910 | 100 assays |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140-079 | 500 mL |
| HIT competent cells | Real Biotech Corporation(RBC) | RH617 | Competent cells |
| HPNE cells | ATCC | CRL-4023 | |
| LB agar broth | Bio Basic | SD7003 | 250 g |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | 0.75 mL |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778-075 | 0.75 mL |
| Luminometer | Promega | Model: E5311 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431021 | |
| Microplate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| miRNA control mimic | Ambion | 4464058 | 5 nmole |
| miRNA-107 mimic | Ambion | 4464066 | 5 nmole |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | 50 prep |
| Mupid-2plus (electrophoresis system) | TaKaRa | Model: AD110 | |
| NotI | New England Biolabs | R3189 | 20,000 units/mL |
| Oligo explorer program | GeneLink | For primer design | |
| Optical tube strip caps (8X Strip) | Agilent Technologies | 401425 | For real time PCR |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | 500 Ml |
| PANC-1 cells | ATCC | CRL-1469 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
| Phosphate buffer saline | Gibco | 14040117 | 1000 mL |
| Plasmid DNA miniprep S& V kit | Bionics | DN10200 | 200 prep |
| PrimeSTAR GXL DNA polymerase | TaKaRa | R050A | 250 units |
| Shaker | TECAN | Shaking platform | |
| Shaking incubator | Labtech | Model: LSI-3016A | |
| Sigmaplot 14 software | Systat Software Inc | For dose-response curve generation | |
| Sulforhodamine B powder | Sigma | S1402-5G | 5 g |
| SYBR green master mix | Smobio | TQ12001805401-3 | Binding fluorescent dye for dsDNA |
| T4 DNA ligase | TaKaRa | 2011A | 25,000 U |
| TaqMan master mix | Applied Biosystems | 4324018 | 200 reactions, no AmpErase UNG |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-107) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000443 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan microRNA assay (hsa-miR-301) | Applied Biosystems | 4427975 | Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns) |
| TaqMan miR RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | 1000 reactions |
| Thermo CO2 incubator (BB15) | ThermoFisher Scientific | 37 °C and 5% CO2 incubation | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | 91228-100G | 100 g |
| Trizma base | Sigma | T4661-100G | 100 g |
| Ultrapure water | Invitrogen | 10977-015 | 500 mL |
| Veriti 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | For amplification of DNA (or cDNA) | |
| XhoI | New England Biolabs | R0146 | 20,000 units/mL |
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