Aplicación de la interferometría de Biolayer (BLI) para el estudio de las interacciones proteínas y proteínas en la transcripción
Summary
Las interacciones de los factores de transcripción (TO) con el ARN polimerasa generalmente se estudian mediante ensayos desplegables. Aplicamos una tecnología Biolayer Interferometry (BLI) para caracterizar la interacción de GrgA con el ARN polimeraso clamítico. En comparación con los ensayos desplegables, BLI detecta la asociación y disociación en tiempo real, ofrece una mayor sensibilidad y es altamente cuantitativa.
Abstract
Un factor de transcripción (TF) es una proteína que regula la expresión génica mediante la interacción con el ARN polimerasa, otro TF y/o el ADN de la plantilla. GrgA es un nuevo activador de transcripción que se encuentra específicamente en el patógeno bacteriano intracelular obligatorio Clamydia. Los ensayos de extracción de proteínas con cuentas de afinidad han revelado que GrgA une dos factores de los mismos, a saber,66 y28,que reconocen diferentes conjuntos de promotores de genes cuyos productos son necesarios diferencialmente en las etapas del desarrollo. Hemos utilizado BLI para confirmar y caracterizar aún más las interacciones. BLI demuestra varias ventajas sobre el desplegable: 1) Revela asociación en tiempo real y disociación entre socios de unión, 2) Genera parámetros cinéticos cuantitativos, y 3) Puede detectar enlaces que los ensayos desplegables a menudo no detectan. Estas características nos han permitido deducir las funciones fisiológicas de la GrgA en la regulación de la expresión génica en la clamidia,y los posibles mecanismos de interacción detallados. Prevemos que esta tecnología relativamente asequible puede ser extremadamente útil para estudiar la transcripción y otros procesos biológicos.
Introduction
La transcripción, que produce moléculas de ARN utilizando el ADN como plantilla, es el primer paso de la expresión génica. La síntesis de ARN bacteriano comienza después de la unión de la holoenzima de ARN polimerasa (RNAP) a un promotor objetivo1,2. La holoenzima RNAP (RNAPholo) se compone de un núcleo catalítico multisubunidad (RNAPcore) y un factor de -, que es necesario para reconocer la secuencia promotora. Los activadores y represores de transcripción, llamados colectivamente TF, regulan la expresión génica a través de los componentes de unión del ARNPcore, los factores y/o el ADN. Dependiendo del organismo, una parte significativa de su genoma puede dedicarse a los TF que regulan la transcripción en respuesta a las necesidades fisiológicas y las señales ambientales3.
La clamidia es una bacteria intracelular obligatoria responsable de una variedad de enfermedades en humanos y animales4,5,6,7,8. Por ejemplo, La clamidia trachomatis es posiblemente el patógeno de transmisión sexual número uno en humanos en todo el mundo, y una de las principales causas de ceguera en algunos países subdesarrollados4,5. La clamidia tiene un ciclo de desarrollo único caracterizado por dos formas celulares alternasque se denominan cuerpo elemental (EB) y reticulado cuerpo (RB) 9. Mientras que, los EB son capaces de sobrevivir en un entorno extracelular, son incapaces de proliferar. Los EB entran en las células huésped a través de la endocitosis y se diferencian en RBs más grandes en una vacuola en el citoplasma del huésped en cuestión de horas después de la inoculación. Ya no son infecciosos, los RAB proliferan a través de la fission binaria. Alrededor de 20 h, comienzan a diferenciar de nuevo a los EB, que salen de las células anfitrionas alrededor de 30-70 h.
La progresión del ciclo de desarrollo clamidia está regulada por la transcripción. Mientras que una supermayoría de los casi 1.000 genes clamidiados se expresan durante el ciclo medio durante el cual los BRAD se replican activamente, sólo un pequeño número de genes se transcriben inmediatamente después de la entrada de los EB en las células huésped para iniciar la conversión de Los EB en los BB, y otro pequeño conjunto de genes se transcriben o se transcriben cada vez más para permitir la diferenciación de los BB en los EB10,11.
El genoma chlamidia codifica tres factores de los que se codifican en los documentos66,28 y54. 66, que es equivalente a la limpieza70 de E. coli y otras bacterias, es responsable de reconocer a los promotores de genes de ciclo temprano y medio, así como a algunos genes tardíos, mientras que los modelos28 y54 son necesarios para la transcripción de ciertos genes tardíos. Se sabe que varios genes llevan tanto a un promotor dependientede66o 66 o a un promotor dependiente de28o2.
A pesar de un ciclo de desarrollo complicado, sólo un pequeño número de TFs se han encontrado en clamidia13. GrgA (anteriormente anotado como una proteína hipotética CT504 en C. trachomatis serovar D y CTL0766 en C. trachomatis L2) es un TF específico de Clamydiainicialmente reconocido como un activador de66genes dependientes14. Los ensayos desplegables de afinidad han demostrado que GrgA activa su transcripción al unir tanto el n.o66 como el ADN. Curiosamente, más tarde se encontró con que GrgA también coprecipita conel 28, y activa la transcripción de los promotores dependientes de28euros in vitro15. Para investigar si GrgA tiene afinidades similares o diferentes por66 y28euros, recurrimos al uso de BLI. Los ensayos de BLI han demostrado que GrgA interactúa conel 66 o 66 con una afinidad 30 veces mayor que conel 28,lo que sugiere que GrgA puede desempeñar roles diferenciales en la transcripción dependiente de66y la transcripción dependiente de28euros 15.
BLI detecta el patrón de interferencia de la luz blanca que se refleja a partir de una capa de proteína inmovilizada en la punta de un biosensor y lo compara con el de una capa de referencia interna16. A través del análisis de estos dos patrones de interferencia, BLI puede proporcionar información valiosa y en tiempo real sobre la cantidad de proteína unida a la punta del biosensor. La proteína que se inmoviliza a la punta del biosensor se conoce como el ligando, y generalmente se inmoviliza con la ayuda de un anticuerpo común o etiqueta de epítopo (por ejemplo, una etiqueta poli-His- o biotina) que tiene una afinidad por una partícula asociada (como NTA o Streptavidin) en la punta del biosensor. La unión de una proteína secundaria, conocida como analito, con el ligando en la punta del biosensor crea cambios en la opacidad del biosensor y, por lo tanto, da lugar a cambios en los patrones de interferencia. Cuando se repite sobre diferentes concentraciones del analito, BLI puede proporcionar no sólo información cualitativa, sino también cuantitativa sobre la afinidad entre el ligando y el analito16.
Hasta donde sabemos, fuimos los primeros en emplear a BLI para caracterizar las interacciones proteína-proteína en la transcripción15. En esta publicación, demostramos que un fragmento de GrgA, que anteriormente se mostraba necesario para el enlace de28euros, de hecho media el enlace. Este manuscrito se centra en los pasos de los ensayos BLI y la generación de gráficos BLI y parámetros de cinética de encuadernación. Los métodos para la producción (y purificación) de ligandos y analitos no están cubiertos aquí.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las interacciones proteínas-proteínas son cruciales para la regulación de la transcripción y otros procesos biológicos. Se estudian más comúnmente a través de ensayos desplegables. Aunque los ensayos desplegables son relativamente fáciles de realizar, son poco cuantitativos y pueden no detectar interacciones débiles pero biológicamente significativas. En comparación, al detectar la asociación y disociación en tiempo real entre un ligando y un analito, BLI proporciona constantes de tasa de asociación y diso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (Grants AI122034 y AI140167) y La Fundación de La Salud de Nueva Jersey (Grant – PC 20-18).
Materials
| BLItz machine | ForteBio | 45-5000 | |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MilliporeSigma | D9652 | |
| Dip and Read Ni-NTA biosensor tray | ForteBio | 18-5101 | Ready-to-use Ni-NTA biosensors for poly-His-tagged Proteins |
| Drop holder | ForteBio | 45-5004 | |
| PCR tubes (0.2 mL) | Thomas Scientific | CLS6571 | |
| Microcentrifuge tubes (black) | Thermo Fisher Scientific | 03-391-166 | |
| Kimwipes | Thermo Fisher Scientific | 06-666A | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| EDTA | MilliporeSigma | E6758 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M8266 | |
| NaCl | MilliporeSigma | S9888 | |
| Tris-HCl | GoldBio | T095100 |
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