전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 슬라이스의 광자 광자 광기록
Summary
전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 조각을 재현하고 안정적으로 광학 기록 하는 방법을 소개합니다. 이 기사에서는 기존의 해마 슬라이스 준비를 사용하여 전압에 민감한 염료 염색 및 광 신호 기록에 대해 설명합니다.
Abstract
뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 에민감한 염료(VSD) 이미징은 신경 회로의 기능적 연결을 평가하는 유용한 도구입니다. 광 신호의 분수 변화로 인해, 이 방법을 정량적 분석법으로 사용하기가 어려웠다. 이 문서에서는 이 기술을 안정적이고 신뢰할 수 있는 특수 광학 및 슬라이스 처리 시스템에 대해 설명합니다. 본 기사에서는 VSD 염색 해마 슬라이스의 슬라이스 처리, 염색 및 기록을 자세히 보여줍니다. 이 시스템은 좋은 염색과 함께 오랜 시간 동안 생리 적 조건을 유지하고, 기록 하는 동안 슬라이스의 기계적 움직임을 방지합니다. 또한 소량의 염료로 조각을 염색 할 수 있습니다. 광학 장치는 낮은 배율에서 높은 수치 조리개를 구현하여 100픽셀 x 100픽셀 공간 해상도로 최대 프레임 속도 10kHz에서 VSD 신호를 기록할 수 있습니다. 높은 프레임 속도와 공간 해상도로 인해 이 기술은 신경 회로의 변화를 평가하기에 충분한 신호 대 잡음 비를 제공하는 사후 기록 필터를 적용합니다.
Introduction
대량 염색 된 뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 감응염 (VSD) 이미징은 신경 회로 1, 2,3,4의 역학을 평가하는 유용한 정량적 도구가되었습니다. . 멤브레인 여기5,6,7,VSD 이미징으로 인한 광학 적 특성의 변화를 분석 한 후 1970 년대 초에 코헨 및 기타6,8에 의해 처음 기재되었습니다. 9. . 염료가 막 전위 변화(즉, 뉴런의 1차 신호)를 직접 프로브하기 때문에 실시간으로 뇌 기능을 모니터링하는 적절한 방법이다.
초기 VSD는 뇌 계통을 이해하는 바람직한 특성을 가지고, 이러한 빠른 시간 상수 와 같은 뉴런 막 전위 사건의 급속한 역학을 따르고, 멤브레인 전위 9의 변화와선형성 10개 , 11세 , 12세 , 13세 , 14세 , 15. 다른 이미징 실험과 유사하게,이 기술은 원하는 결과를 달성하기 위해 카메라, 광학, 소프트웨어 및 슬라이스 생리학과 같은 광범위한 특정 튜닝을 필요로합니다. 이러한 기술적 함정 으로 인해 초기 노력 중 예상되는 이점은이 기술을 전문으로하지 않은 대부분의 실험실에서 반드시 구체화되지는 않았습니다.
기술적 난이도의 원초적 원인은 슬라이스 제제의 대량 염색에 적용될 때 멤브레인 전위 변화에 대한 VSD의 낮은 민감도였다. 광 신호의 크기(즉, 형광의 분수 변화)는 일반적으로 생리적 조건하에서 대조군(F0) 신호의 10-4-10-3이다. 뉴런의 막 전위 변화의 시간 척도는 약 밀리초에서 수백 밀리초까지입니다. 뉴런의 멤브레인 전위 변화를 측정하기 위해 레코딩에 사용되는 카메라는 고속(10kHz ~ 100Hz)의 이미지를 획득할 수 있어야 합니다. VSD의 낮은 감도와 신경 신호를 따르는 데 필요한 속도는 높은 신호 대 잡음 비 (S / N)2,16으로고속으로 카메라에서 많은 양의 빛을 수집해야합니다.
레코딩 시스템의 광학 장치는 충분한 빛의 수집을 보장하고 S/N을 개선하는 데 중요한 요소입니다. 광학에 의해 달성된 배율은 종종 국소 기능신경회로를 가시화하기 위해 1X ~ 10X와 같이 지나치게 낮습니다. 예를 들어, 해마 회로의 역학을 시각화하기 위해 약 5의 배율이 적합할 것입니다. 이러한 낮은 배율은 낮은 형광 효율을 가지고; 따라서 고급 광학은 이러한 기록에 도움이 될 것입니다.
또한 슬라이스 생리학도 필수적입니다. 이미징 분석에는 슬라이스가 손상되지 않도록 해야 하므로17. 또한, 더 긴 시간 동안 슬라이스 생존을 유지하기 위해 취한 조치는 중요하다18.
이 문서에서는 슬라이스, VSD 염색 및 측정을 준비하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 문서에서는 또한 VSD, 이미징 장치 및 광학에 대한 개선 사항 및 이 방법을 간단하고 강력하며 정량적 분석으로 사용할 수 있게 한 실험 시스템에 대한 기타 추가 개선 사항에 대해 설명합니다. 뇌 기능의 수정19,20,21,22,23,24,25. 이 기술은 또한 해마 슬라이스1의CA1 영역에서 장기 적인 약식에 널리 사용될 수 있다. 더욱이, 이 기술은 단일 신경 세포(26)에서막 전위(26)의 광학 기록에도 유용하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
슬라이스 생리학은 올바른 신호를 수집하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜에서 링 멤브레인 필터 시스템을 사용하면 절차 2,16및17에서 슬라이스가 건강하고 왜곡되지 않은 상태로 유지됩니다. 다른 시스템은 기록 하는 동안 슬라이스 생리학을 유지 하는 데 사용할 수 있습니다., 하지만 이미징 건강 한 슬라이스의 모든 부분을…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TT는 JSPS 카켄히 그랜트 (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K00038, JP15K00413) 및 후생노동성(MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] 및 H30 [1806216])의 보조금. 우리는 영어 편집에 대한 편집 (www.editage.jp)에 감사드립니다.
Materials
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM – Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/ 0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer / Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
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