Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi
Summary
Descriviamo le procedure per l’elaborazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici ad alta risoluzione per l’analisi morfolometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi. I micrografi ottenuti con questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia di un certo numero di altri componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali.
Abstract
Il nostro laboratorio e molti altri hanno sfruttato l’alto potere risolutivo della microscopia elettronica di trasmissione per studiare la morfologia e l’organizzazione spaziale delle vescicole sinaptiche. Al fine di ottenere micrografi elettronici di alta qualità che possono produrre il grado di dettaglio morfologico necessario per l’analisi quantitativa della distribuzione della vescicola pre-sinaptica, la preparazione ottimale dei campioni è critica. La fissazione chimica è il primo passo nel processo di preparazione del provino, e della massima importanza per preservare l’ultrastruttura fine. La fissazione vascolare con una soluzione di glutaraldeide-formaldeide, seguita dal trattamento di esemplari sezionati con vibratoma con tetroxide di osmio, stabilizza il numero massimo di molecole, in particolare proteine e lipidi, e si traduce in una conservazione superiore di ultrastruttura. Il tessuto viene quindi elaborato con controcolorazione, disidratazione sequenziale e resina-incorporamento. La colorazione in blocco con l’acetato di uranile (cioè la colorazione del tessuto vibratoma-sezionato prima dell’incorporamento della resina) migliora il contrasto endogeno e stabilizza i componenti cellulari contro l’estrazione durante la lavorazione del campione. Il contrasto può essere ulteriormente aumentato applicando l’acetato di uranile come post-macchia su sezioni ultrasottile. La doppia colorazione delle sezioni ultrasottile con citrato di piombo dopo il trattamento con acetato di uranile migliora anche la risoluzione dell’immagine, intensificando l’opacità dell’elettrone delle strutture contenenti acido nucleico attraverso il legame selettivo del piombo all’acetato di uranile. La microscopia elettronica di trasmissione è un potente strumento per la caratterizzazione dei dettagli morfologici delle vescicole sinaptiche e la quantificazione delle loro dimensioni e organizzazione spaziale nel bouton terminale. Tuttavia, poiché utilizza il tessuto fisso, la microscopia elettronica di trasmissione può fornire solo informazioni indirette sui processi viventi o in evoluzione. Pertanto, altre tecniche dovrebbero essere prese in considerazione quando l’obiettivo principale è quello di studiare aspetti dinamici o funzionali del traffico di vescicole sinaptiche ed esocitosi.
Introduction
Descriviamo i metodi per la preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici di alta qualità per l’analisi morfolometrica approfondita della distribuzione spaziale della vescicola sinaptica ai terminali nervosi1,2. I micrografi ad alto contrasto che possono essere ottenuti elaborando campioni seguendo questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia dettagliata di un certo numero di componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali3,4.
Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) è un potente strumento per studiare quantitativamente la morfologia degli organelli e di altre strutture cellulari. A partire da questo decennio, non ci sono altri metodi di indagine che possono fornire lo stesso grado di risoluzione delle membrane lipidiche e organelli senza immuno-tagging, ad eccezione della criofissazione da congelamento ad alta pressione. Tuttavia, le tecniche di sostituzione del congelamento non sono ampiamente utilizzate, e normalmente richiedono attrezzature costose e lunghi tempi di preparazione.
Al fine di sfruttare l’elevata potenza risolutivo di TEM, la preparazione ottimale dei campioni è di fondamentale importanza. Gli obiettivi principali della preparazione dei campioni sono di preservare la struttura tissutale con minime alterazioni dallo stato vivente, migliorare il contrasto dei campioni e stabilizzare il tessuto contro l’estrazione dei componenti cellulari durante la lavorazione e l’esposizione all’elettrone Raggio. Numerosi protocolli per la preparazione dei tessuti TEM sono stati introdotti e perfezionati da diversi laboratori nel corso degli anni. Molti di loro si sono concentrati sui metodi per una visualizzazione ottimale delle vescicole sinaptiche5,6,7,8,9,10,11. Tra una serie di metodi standard d’oro consolidati attualmente in uso, abbiamo scelto procedure per la fissazione chimica, la post-fissazione, la colorazione in blocco, la disidratazione sequenziale, l’incorporamento di resina e la colorazione post che mirano a preservare la struttura dei tessuti ottimale e ottenere un eccellente contrasto dell’immagine. Di nota, la conservazione di ultrastruttura fine può essere particolarmente impegnativo quando si lavora con il tessuto cerebrale del ratto neonato. Infatti, il sistema nervoso centrale di animali molto giovani è caratterizzato da un maggiore contenuto di acqua rispetto al cervello adulto, più prominente allargamento degli spazi extracellulari, e connessioni più allentati tra le cellule12. Questo rende il tessuto cerebrale del ratto neonato profondamente sensibile ai cambiamenti nell’osmolarità, e squisitamente incline al restringimento degli artefatti e/o gonfiore quando elaborato attraverso soluzioni sequenziali di diversa tonicità12. Pertanto, i nostri metodi impiegati soluzioni per la lavorazione dei campioni che sono di osmolarità il più vicino possibile a quella del cervello neonato ratto. Il nostro obiettivo era ottenere immagini di microscopia elettronica ad alta risoluzione di alta qualità per la valutazione quantitativa della distribuzione spaziale della vescicola sinaptica nei terminali nervosi. In particolare, abbiamo cercato di misurare il numero di vescicole all’interno del terminale nervoso, la distanza delle vescicole sinaptiche dalla membrana plasmatica pre-sinaptica, il numero di vescicole ancorate alla membrana pre-sinaptica, la dimensione delle vescicole sinaptiche e la Distanze intervescicole1.
Una fissazione chimica soddisfacente è un prerequisito per ottenere micrografi elettronici di alta qualità in grado di fornire il dettaglio morfologico necessario per studiare la morfologia e l’organizzazione spaziale della vescicola sinaptica. Sebbene esistano diverse modalità di fissazione, la fissazione del tessuto cerebrale mediante perfusione vascolare è decisamente superiore ad altri metodi. Poiché la fissazione tramite perfusione vascolare inizia immediatamente dopo l’arresto della circolazione sistemica, accorcia l’intervallo tra la deossigenazione del tessuto cerebrale e il cross-linking delle proteine con fissativi, con conseguente alterazioni minime nelle cellule struttura. Inoltre, realizza una penetrazione veloce e uniforme, a causa del rapido flusso del fissativo dal letto vascolare ai compartimenti extracellulari e cellulari12,13,14. La fissazione primaria con glutaraldeide, seguita da fissazione secondaria (post-fissazione) con tetroxide di osmio, produce un’eccellente preservazione della struttura fine15,16,17. Una miscela di glutaraldeide e paraformaldeide ha il vantaggio aggiuntivo di una penetrazione più rapida nel tessuto12.
Poiché i tessuti biologici non sono sufficientemente rigidi per essere tagliati in sezioni sottili senza il supporto di una matrice di resina, devono essere incorporati in un mezzo prima del sezionamento sottile. Le resine epossidiche immiscibili in acqua sono comunemente utilizzate come mezzo di incorporamento in TEM. Quando si utilizza questo tipo di matrice, l’acqua libera del campione deve essere sostituita con un solvente organico prima dell’infiltrazione di resina. L’acqua viene rimossa passando il provino attraverso una serie di soluzioni di concentrazioni ascendenti di etanolo e/o acetone12. In questo protocollo, i campioni sono primi piatti incorporati tra fogli di Aclar flessibili, quindi incorporati in una capsula. Il risultato finale è il tessuto situato sulla punta di un blocco di resina cilindrica, che ha la geometria ideale per essere meno influenzato dalle vibrazioni derivanti durante il sezionamento del microtomo.
La colorazione con metalli pesanti per migliorare il contrasto del tessuto endogeno è un altro aspetto importante della preparazione dei campioni. Il contrasto dell’immagine in TEM è dovuto alla dispersione di elettroni da parte degli atomi nel tessuto. Tuttavia, i materiali biologici consistono in gran parte di molecole a basso peso atomico (cioè carbonio, idrogeno, ossigeno e azoto). Pertanto, la generazione di un contrasto di dispersione sufficiente richiede l’incorporazione di atomi di peso atomico elevato nei componenti cellulari del tessuto. Ciò si ottiene attraverso la colorazione del campione con metalli pesanti12,18,19. Tetroxide di osmio, uranio e piombo, che si legano fortemente ai lipidi, sono i metalli pesanti più comuni utilizzati come macchie di elettroni.
L’osmio (numero atomico 76) è uno dei metalli più densi esistenti. È sia un fissativo che una macchia, anche se il suo ruolo primario in TEM è come un fissativo affidabile12. Tra i vari protocolli di fissazione in uso, il metodo di doppia fissazione con glutaraldeide seguita da osmio è il più efficace nel ridurre l’estrazione dei costituenti delle cellule durante la preparazione del provino. Questi due fissativi sono utilizzati per stabilizzare il numero massimo di diversi tipi di molecole, in particolare proteine e lipidi, e si traducono in una preservazione superiore dell’ultrastruttura tissutale12,14,15, 16 anni di , 17. la
L’uranio (numero atomico 92) è il metallo più pesante utilizzato come macchia elettronica, più tipicamente sotto forma di acetato di uranile. Analogamente all’osmio, agisce come una macchia e fissativo, anche se il suo ruolo primario in tem è come una macchia20,21. Le strutture contenenti acido nucleico e membranose sono fortemente e preferenzialmente macchiate con sali di uranile in tessuti fissi aldeidi22,23. Il trattamento dei tessuti con acetato di uranile dopo l’osmicazione e prima della disidratazione provoca la stabilizzazione di strutture membranose e contenenti acido nucleico, nonché un maggiore contrasto, e consente l’identificazione di alcuni dettagli strutturali che non essere facilmente rilevati in esemplari macchiati con osmio da solo12,24,25. Si pensa che l’acetato di uranile possa stabilizzare la struttura fine combinando con l’osmio ridotto che è stato depositato sulle membrane lipidiche durante l’osmicazione24. Il contrasto massimo si ottiene quando l’acetato di uranile viene applicato prima dell’incorporamento e come post-macchia nelle sezioni sottili12.
Piombo (numero atomico 82) è la macchia più comune utilizzata per TEM ed è principalmente impiegata per la post-colorazione di sezioni sottili. I sali di piombo hanno un’elevata opacità degli elettroni e mostrano affinità per una vasta gamma di strutture cellulari, tra cui membrane, proteine nucleari e citoplasmatiche, acidi nucleici e glicogeno26,27. Quando il metodo della doppia colorazione è impiegato (cioè, la colorazione con l’acetato di uranile è seguita dal trattamento con piombo), quest’ultimo agisce come sviluppatore di colorazione di acetato di uranile. Per esempio, il piombo post-colorazione della cromatina fissa con glutaraldeide aumenta l’assorbimento di uranile acetato di un fattore di tre28,29, 30,31,32. Il piombo migliora anche la colorazione impartita da altri metalli come l’osmio. Si ritiene che i sali di piombo macchiavano le membrane dei tessuti fissi di osmio attaccando al gruppo polare di fosfatidi in presenza di un ridotto Osmio33. Un potenziale svantaggio della colorazione sia con l’acetato di uranile che con il piombo, soprattutto per le durate prolungate, è che molti elementi strutturali diversi sono macchiati ugualmente e non specificamente, e quindi non possono essere facilmente distinti l’uno dall’altro12 .
La recente introduzione di fonti di luce alternative, come nella microscopia di localizzazione fotografica a Super risoluzione ottica, ha migliorato significativamente la risoluzione della microscopia della luce34. Tuttavia, poiché la microscopia leggera si basa su metodi istochimici e immunocicaminici per visualizzare proteine o enzimi etichettati individualmente, la potenza di TEM per visualizzare tutti gli elementi strutturali in una sola volta rimane insuperata per uno studio approfondito del morfologia e le relazioni dimensionali delle strutture tissutali. In particolare, nessun’altra tecnica può fornire il dettaglio morfologico necessario per eseguire l’analisi morfologica della distribuzione delle vescicole sinaptiche a attacchi nervosi pre-sinaptici. Tuttavia, è importante notare che i micrografi elettronici catturano la struttura del tessuto dopo che l’organismo muore, e quindi non possono fornire informazioni sulle dinamiche del traffico di vescicole pre-sinaptiche ed esocitosi. Pertanto, altri strumenti, come ad esempio il colorante FM-Live Imaging e l’elettrofisiologia patch-clamp, dovrebbero essere presi in considerazione quando l’obiettivo principale è quello di studiare gli aspetti dinamici e/o funzionali del traffico di vescicole sinaptiche e dell’esocitosi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La manipolazione delle sezioni tissutali durante la preparazione del campione per TEM richiede un notevole grado di finezza, concentrazione e pazienza. Quando si utilizza una micropipetta per aggiungere e rimuovere soluzioni, i campioni possono essere aspirati nella punta della pipetta dalla tensione superficiale, pertanto è necessario prestare molta attenzione per evitare danni ai tessuti da parte della pipetta. Inoltre, alcuni passaggi della sequenza di disidratazione possono essere rapidi come 1 min, quindi l’operato…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo manoscritto è stato supportato da NIH/NIGMS K08 123321 (a N.L.) e dai fondi del dipartimento di anestesiologia presso l’Università della Virginia. Gli autori desiderano ringraziare Alev Erisir (dipartimento di biologia, Università della Virginia, Charlottesville, VA) per un’eccellente formazione e assistenza tecnica con TEM, e per la sua preziosa critica manoscritta. Gli autori ringraziano inoltre la struttura avanzata di microscopia elettronica presso l’Università della Virginia per l’assistenza tecnica con sezionamento e post-colorazione dei campioni.
Materials
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | size "00", flat |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
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