Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen
Summary
Hier stellen wir mehrere einfache Methoden zur Beurteilung der Lebensfähigkeit und des Todes in 3D-Krebszellsphäroiden vor, die die physikalisch-chemischen Gradienten von In-vivo-Tumoren viel besser imitieren als die 2D-Kultur. Das Sphäroid-Modell ermöglicht daher die Bewertung der Wirksamkeit des Krebsmedikaments mit verbesserter Übersetzung in In-vivo-Bedingungen.
Abstract
Dreidimensionale Sphäroide von Krebszellen sind wichtige Werkzeuge sowohl für Krebsmedikamenten-Screens als auch für den Gewinn mechanistischer Einblicke in die Krebszellbiologie. Die Kraft dieses Präparats liegt in seiner Fähigkeit, viele Aspekte der In-vivo-Bedingungen von Tumoren zu imitieren, während es schnell, billig und vielseitig genug ist, um ein relativ hohes Durchsatzscreening zu ermöglichen. Die Sphäroid-Kulturbedingungen können die physikalisch-chemischen Gradienten in einem Tumor rekapitulieren, einschließlich der zunehmenden extrazellulären Säure, erhöhtem Laktat und abnehmender Glukose- und Sauerstoffverfügbarkeit, von der Sphäroid-Peripherie bis zu ihrem Kern. Auch die mechanischen Eigenschaften und Zell-Zell-Wechselwirkungen von In-vivo-Tumoren werden teilweise von diesem Modell nachgeahmt. Die spezifischen Eigenschaften und damit die optimalen Wachstumsbedingungen von 3D-Sphäroiden unterscheiden sich stark zwischen den verschiedenen Arten von Krebszellen. Darüber hinaus erfordert die Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroiden Methoden, die sich zum Teil von denen unterscheiden, die für 2D-Kulturen verwendet werden. Hier beschreiben wir mehrere Protokolle zur Herstellung von 3D-Sphäroiden von Krebszellen und für die Verwendung solcher Kulturen zur Bewertung der Zelllebensfähigkeit und des Todes im Zusammenhang mit der Bewertung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten.
Introduction
Die Verwendung von mehrzelligen Sphäroid-Modellen in der Krebsbiologie ist mehrere Jahrzehnte alt1,2, hat aber in den letzten Jahren erhebliche Dynamik gewonnen. Dies spiegelt zum großen Teil das erhöhte Bewusstsein dafür wider, wie stark der Phänotyp von Krebszellen von ihrer Mikroumgebung und spezifischen Wachstumsbedingungen abhängig ist. Die Mikroumgebung bei soliden Tumoren unterscheidet sich grundlegend von der in entsprechenden normalen Geweben. Dazu gehören physikalisch-chemische Bedingungen wie pH, Sauerstoffspannung, sowie interstitielle Druck, Konzentrationsgradienten von löslichen Faktoren wie Nährstoffe, Abfallprodukte, und sezernierte Signalverbindungen (Wachstumsfaktoren, Zytokine). Darüber hinaus umfasst es die Organisation der extrazellulären Matrix (ECM), Zell-Zell-Wechselwirkungen und interzelluläre Signalisierung, und andere Aspekte der jeweiligen dreidimensionalen (3D) Architektur des Tumors3,4, 5,6. Die spezifischen mikroökologischen Bedingungen, in denen Krebszellen existieren, beeinflussen ihr Genexpressionsprofil und ihre funktionellen Eigenschaften tiefgreifend, und es ist klar, dass der Phänotyp von 3D-Sphäroiden im Vergleich zu den in 2D angebauten Zellen viel stärker imitiert. die von In-vivo-Tumoren7,8,9,10,11. 2D-Modelle, selbst wenn sie Hypoxie, sauren pH-Wert und hohe Laktatkonzentrationen verwenden, um bekannte Aspekte der Tumormikroumgebung zu imitieren, erfassen immer noch nicht die Gradienten physikalisch-chemischer Parameter, die in Tumoren entstehen, sowie deren 3D-Tumor architektur. Auf der anderen Seite sind Tiermodelle kostspielig, langsam und ethisch problematisch und haben im Allgemeinen auch Mängel in ihrer Fähigkeit, menschliche Tumorbedingungen zu rekapitulieren. Folglich wurden 3D-Sphäroide als Zwischenkomplexitätsmodell in Studien zu einer Vielzahl von Eigenschaften der meisten soliden Krebsartenangewendet 9,11,12,13, 14,15,16,17.
Eine weit verbreitete Verwendung von 3D-Sphäroide ist in Screening-Assays der Anti-Krebs-Therapie Wirksamkeit9,18,19,20. Behandlungsreaktionen sind besonders empfindlich auf die Tumormikroumgebung und spiegeln sowohl die Auswirkungen der Tortuosität, die eingeschränkte Diffusion, den hohen interstitiellen Druck und den sauren Umwelt-pH-Wert auf die Arzneimittelabgabe als auch die Auswirkungen von Hypoxie und anderen Aspekte der Mikroumgebung auf der Zelltodreaktion9,17. Da die Umgebung innerhalb von 3D-Sphäroiden von Natur aus alle diese Eigenschaften entwickelt7,8,9,10,11, mit 3D-Zellkulturen können die Übersetzung der Ergebnisse in in vivo-Bedingungen erheblich zu verbessern, ermöglichen jedoch ein effizientes und erschwingliches Hochdurchsatz-Screening des Nettowachstums. Die große Mehrheit der Studien über die medikamentöse Reaktion von Krebszellen wird jedoch immer noch unter 2D-Bedingungen durchgeführt. Dies spiegelt wahrscheinlich wider, dass, während einige Assays relativ leicht für 3D-Zellkulturen implementiert werden können, viele, wie Lebensfähigkeits-Assays, Western-Blotting und Immunfluoreszenz-Analyse, viel bequemer in 2D als in 3D durchgeführt werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, leicht zugängliche Assays und präzise Protokolle für Analysen der Wirkung der Behandlung mit Krebsmedikamenten auf die Lebensfähigkeit und das Überleben von Krebszellen in einem 3D-Tumor zu liefern, der eine Nachahmung simmiert. Insbesondere bieten und vergleichen wir drei verschiedene Methoden zur Sphäroidbildung, gefolgt von Methoden zur qualitativen und quantitativen Analyse von Wachstum, Lebensfähigkeit und Arzneimittelreaktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von 3D-Krebszellsphäroiden hat sich als wertvolles und vielseitiges Werkzeug nicht nur für das Screening von Krebsmedikamenten erwiesen, sondern auch für den Gewinn mechanistischer Einblicke in die Regulierung des Krebszellsterbens und der Lebensfähigkeit unter Bedingungen, die diejenigen im Tumor imitieren. Mikroumgebung. Dies ist besonders wichtig, da die Zugänglichkeit, zelluläre Aufnahme und intrazelluläre Wirkung von Chemotherapeutika durch die physikalisch-chemischen Bedingungen im Tumor, eins…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Katrine Franklin Mark und Annette Bartels für die hervorragende technische Unterstützung und Asbjarn N’hr-Nielsen für die Durchführung der Experimente in Figur 1D. Diese Arbeit wurde von der Einar Willumsen Foundation, der Novo Nordisk Foundation und der Fondation Juchum (alle an SFP) finanziert.
Materials
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Recherche en cancérologie. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J., Teicher, B. A. . Cancer Drug Resistance. , 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Recherche en cancérologie. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour – endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
