암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가
Summary
여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.
Abstract
암세포의 3차원 스페로이드는 암 약물 스크린과 암 세포 생물학에 대한 기계적 통찰력을 얻기 위한 중요한 도구입니다. 이 준비의 힘은 상대적으로 높은 처리량 검열을 허용하기 위하여 충분히 빠르고, 싸고, 다재다능하면서 종양의 생체 내 조건의 많은 양상을 모방하는 그것의 기능에 있습니다. 스페로이드 배양 조건은 종양에 있는 물리 화학 구배를 되풀이할 수 있습니다, 세포외 산도 증가 포함, 증가한 젖산, 및 포도당 과 산소 가용성 감소, 그것의 코어에 구형 주변에서. 또한, 생체 내 종양의 기계적 특성 및 세포-세포 상호 작용은 부분적으로 이 모델에 의해 모방된다. 특정 특성 및 결과적으로 최적의 성장 조건, 3D 스페로이드의, 암 세포의 다른 유형 사이 크게 다릅니다. 게다가, 3D 스페로이드에 있는 세포 생존성 그리고 죽음의 평가는 2D 문화를 위해 채택된 것과 부분적으로 다른 방법을 요구합니다. 여기에서 우리는 암세포의 3D 스페로이드를 준비하기 위한 몇몇 프로토콜을 기술하고, 항암제의 효험을 평가하는 맥락에서 세포 생존력 및 죽음을 평가하기 위하여 그 같은 문화를 이용하기 위한.
Introduction
암 생물학에서 다세포 스페로이드 모델의 사용은 수십년 된 1,2,그러나 최근 몇 년 동안 상당한 모멘텀을 얻고있다. 큰 부분에서, 이것은 암세포의 표현형이 그들의 미세 환경 및 특정 성장 조건에 얼마나 강하게 의존하는지의 증가한 의식을 반영합니다. 고형 종양의 미세 환경은 상응하는 정상 조직에서의 미세 환경과 근본적으로 다릅니다. 여기에는 pH, 산소 장력과 같은 물리 화학 적 조건뿐만 아니라 간질 압력, 영양분, 노산물 및 분비 된 신호 화합물 (성장 인자, 사이토 카인)과 같은 수용성 인자의 농도 구배가 포함됩니다. 더욱이, 종양3,4의세포외 기질(ECM), 세포-세포 상호작용 및 세포간 신호화, 및 특정 3차원(3D) 아키텍처의 다른 양상들의 조직을포함한다. 5,6. 암세포가 존재하는 특정 미세 환경 조건은 유전자 발현 프로필 및 기능적 특성에 심오하게 영향을 미치며, 2D로 자란 세포의 표현형에 비해 3D 스페로이드의 표현형이 훨씬 더 밀접하게 모방된다는 것은 분명합니다. 생체 내 종양의7,8,9,10,11. 2D 모델은 저산소증, 산성 pH 및 높은 젖산 농도를 사용하여 종양 미세 환경의 알려진 측면을 모방하더라도 종양 내에서 발생하는 물리 화학 적 매개 변수와 3D 종양의 구배를 포착하지 못합니다. 아키텍처. 다른 한편으로는, 동물 모형은 비용이 많이 들고, 느리고, 윤리적으로 문제가 있고, 일반적으로, 또한 인간 적인 종양 조건을 되풀이하는 그들의 기능에 있는 결점이 있습니다. 따라서, 3D 스페로이드는 대부분의 고형암9,11, 12,13의광범위한 특성에 대한 연구에서 중간 복잡성 모델로적용되었습니다. 14,15,16,17.
3D 스페로이드의 널리 사용되는 사용은 항암 치료 효능 9,18,19,20의스크리닝 검문 검사에 있다. 처리 반응은 종양 미세 환경에 특히 민감하며, 불법 행위의 영향, 제한된 확산, 높은 간질 압력 및 약물 전달에 대한 산성 환경 pH, 저산소증 및 기타 의 영향을 모두 반영합니다. 세포 사멸 반응에 대한미세 환경의 양상 9,17. 3D 스페로이드 내의 환경은 본질적으로 이러한 속성 7,8,9,10,11을모두 개발하기 때문에 3D 세포 배양을 채택할 수 있습니다. 결과의 결과를 생체 내 조건으로 실질적으로 향상시키면서도 순 성장의 효율적이고 저렴한 고처리량 스크리닝을 허용합니다. 그러나, 암세포의 약물 반응에 대한 연구의 대부분은 여전히 2D 조건 하에서 수행된다. 이것은 몇몇 분석실험이 3D 세포 배양을 위해 상대적으로 쉽게 구현될 수 있는 동안, 생존성 분석실험, 서쪽 blotting 및 면역형광 분석과 같은 많은 것이 3D에서 보다는 2D에서 훨씬 더 편리하게 행해질 수 있다는 것을 반영합니다.
본 연구의 목적은 암세포 생존력및 생존에 대한 항암제 치료의 효과를 분석하기 위한 용이한 분석및 정밀한 프로토콜을 3D 종양 모방 설정에서 제공하는 것이다. 구체적으로, 우리는 스페로이드 형성을 위한 3개의 다른 방법을 제공하고 비교하고, 성장, 생존력 및 약물 반응의 정성적 및 정량적 분석을 위한 방법에 선행합니다.
Protocol
1. 스페로이드 생성 스페로이드 형성을 위한 세포 현탁액 준비참고: 다른 세포주들은 매우 다른 접착 특성을 가지며, 각각의 경우에 가장 적합한 스페로이드 형성 프로토콜을 확립해야 합니다. 우리는 MCF-7과 BxPC-3 세포가 자발적인 스페로이드 형성에 적합하다는 것을 것을을 발견했습니다, MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 및 MiaPaCa는 성공적으로 스페로이드를 형성하기 위하여 재구성된…
Representative Results
도 1A 및 도 1B에도시된 스페로이드 형성 프로토콜에 기초한 스페로이드 성장 분석은 3D 종양에서 항암 약물 치료의 효과를 분석하기 위한 출발점으로 사용되었습니다. 설정을 모방합니다. 스페로이드가 형성되는 용이성은 세포주 특이적이며, 일부 세포주는 일관된 스페로이드22를형성하기 위해 rBM을 보충해?…
Discussion
3D 암 세포 스페로이드의 사용은 항암제 스크리닝뿐만 아니라 종양을 모방한 조건하에서 암세포 사멸 및 생존가능성에 대한 기계적 통찰력을 얻기 위한 귀중하고 다양한 도구임이 입증되었습니다. 미세 환경. 이것은 화학요법 약의 접근성, 세포 장악 및 세포내 효력이 pH, 산소 긴장, tortuosity 및 물리적 인 및 종양에 있는 physico 화학 조건에 의해 심오하게 영향을 미치기 때문에 특히 중요합니다 화?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우수한 기술 지원을 위한 캐서린 프랭클린 마크와 아네트 바텔스와 그림 1D에서 실험을 수행에 대한 Asbjørn Nøhr-닐슨에 감사드립니다. 이 작품은 에이나르 윌럼슨 재단, 노보 노디스크 재단, 주훔 재단(모두 SFP)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
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Citer Cet Article
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