Bedömning cell livs kraft och död i 3D Sfäroiden kulturer av cancer celler
Summary
Här presenterar vi flera enkla metoder för att utvärdera lönsamhet och död i 3D-cancer cell sfäroider, som efterliknar fysikalisk-kemiska gradienter av in vivo tumörer mycket bättre än 2D-kulturen. Den sfäroiden modell, därför, tillåter utvärdering av cancer drogen effekt med förbättrad översättning till in vivo villkor.
Abstract
Tredimensionella sfäroider av cancer celler är viktiga verktyg för både cancer drog skärmar och för att få mekanistisk insikt i cancer cell bio Logi. Kraften i denna beredning ligger i dess förmåga att efterlikna många aspekter av in vivo förhållanden av tumörer samtidigt som snabb, billig och mångsidig nog att tillåta relativt hög genom strömning screening. Den sfäroiden kultur förhållanden kan upprepa de fysikalisk-kemiska gradienter i en tumör, inklusive den ökande extracellulär syra, ökad laktat, och minskar glukos och syre tillgänglighet, från sfäroid periferi till sin kärna. Också, de mekaniska egenskaperna och cell-cell interaktioner av in vivo tumörer är delvis härmade av denna modell. De specifika egenskaper och därmed den optimala odlings förhållanden, av 3D sfäroider, skiljer sig mycket mellan olika typer av cancer celler. Dessutom kräver bedömningen av cellernas livs kraft och död i 3D-sfäroider metoder som skiljer sig delvis från dem som används för 2D-kulturer. Här beskriver vi flera protokoll för att förbereda 3D sfäroider av cancer celler, och för att använda sådana kulturer för att bedöma cellernas livs kraft och död i samband med utvärdering av effekten av läkemedel mot cancer.
Introduction
Användningen av multicellulära sfäroiderna modeller i cancer bio Logi är flera decennier gammal1,2, men har fått betydande driv kraft under de senaste åren. Till stor del återspeglar detta ökad medvetenhet om hur starkt fenotyp av cancer celler är beroende av deras mikromiljö och specifika tillväxt förhållanden. Mikromiljön i solida tumörer skiljer sig fundamentalt från den i motsvarande normala vävnader. Detta inkluderar fysikalisk-kemiska förhållanden såsom pH, syre spänning, samt interstitiell tryck, koncentrations gradienter av lösliga faktorer såsom näringsämnen, avfalls produkter, och utsöndras signalering föreningar (tillväxtfaktorer, cytokiner). Dessutom omfattar det organisationen av extracellulär matrix (ECM), cell-cell interaktioner och intercellulära signalering, och andra aspekter av den särskilda tredimensionella (3D) arkitektur av tumören3,4, 5,6. De specifika mikromiljömässiga förhållanden i vilka cancer celler existerar, djupt påverka deras gen uttrycks profil och funktionella egenskaper, och det är tydligt att, jämfört med den hos celler som odlas i 2D, den fenotyp av 3D sfäroider mycket mer imiterar det av in vivo-tumörer7,8,9,10,11. 2D-modeller, även om de använder hypoxi, sura pH, och höga laktat koncentrationer att efterlikna kända aspekter av tumörens mikromiljö, fortfarande inte fånga gradienter av fysikalisk-kemiska parametrar som uppstår inom tumörer, liksom deras 3D-tumör Arkitekturen. Å andra sidan, djur modeller är dyra, långsamma och etiskt problematiska, och i allmänhet, har också brister i deras förmåga att upprepa mänskliga tumör förhållanden. Följaktligen har 3D-sfäroider tillämpats som en intermediär komplexitets modell i studier av ett brett spektrum av egenskaper hos de flesta solida cancer former9,11,12,13, 14,15,16,17.
En allmänt anställd användning av 3D sfäroider är i screening analyser av cancer terapi effekt9,18,19,20. Behandlings svar är särskilt känsliga för tumörmikromiljö, vilket återspeglar både effekten av tortuositet, begränsad diffusion, hög interstitiell tryck, och sura miljömässiga pH på läkemedelstillförsel, och effekterna av hypoxi och andra aspekter av mikromiljö på celldöd svar9,17. Eftersom miljön inom 3D sfäroider naturligt utvecklar alla dessa egenskaper7,8,9,10,11, anställa 3D cell kulturer kan avsevärt förbättra översättningen av resultaten till in vivo-förhållanden, men samtidigt möjliggöra en effektiv och prisvärd screening av netto tillväxten. Emellertid, den stora majoriteten av studier på drogen svar av cancer celler är fortfarande utförs under 2D villkor. Detta återspeglar sannolikt att, medan vissa analyser relativt enkelt kan genomföras för 3D cell kulturer, många, såsom genomförbarhet analyser, Western blotting, och immunofluorescens analys, är mycket mer bekvämt gjort i 2D än i 3D.
Syftet med det nuvarande arbetet är att ge lätt mottaglig analyser och precisa protokoll för analyser av effekten av behandling med anti-cancer läkemedel på cancer cellernas livs kraft och överlevnad i en 3D-tumör härma inställning. Specifikt, vi tillhandahåller och jämför tre olika metoder för sfäroiden bildas, följt av metoder för kvalitativa och kvantitativa analyser av tillväxt, lönsamhet och drog svar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av 3D cancer cell sfäroider har visat sig vara en värdefull och mångsidig verktyg inte bara för cancer läkemedel screening, men också för att få mekanistiska insikt i regleringen av cancer celldöd och livs kraft under förhållanden imitera dem i tumören mikromiljö. Detta är särskilt viktigt eftersom tillgängligheten, cellulära upptag, och intracellulära effekter av kemoterapeutiska läkemedel är djupt påverkad av de fysikalisk-kemiska förhållandena i tumören, inklusive pH, syre spänni…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot Katrine Franklin mark och Annette Bartels för utmärkt teknisk assistans och Asbjørn Nøhr-Nielsen för att ha utfört experimenten i figur 1D. Detta arbete finansierades av Einar Willumsen Foundation, Novo Nordisk Foundation, och Fondation Juchum (alla till SFP).
Materials
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Recherche en cancérologie. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J., Teicher, B. A. . Cancer Drug Resistance. , 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Recherche en cancérologie. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour – endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
