Análise de interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas de fermentação de banho in vitro
Summary
Descrito aqui é um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas in vitro de fermentação em lote.
Abstract
Os microrganismos intestinais humanos tornaram-se recentemente um importante alvo de pesquisa na promoção da saúde humana e prevenção de doenças. Conseqüentemente, investigações de interações entre endobióticos (por exemplo, drogas e prebióticos) e microbiota intestinal tornaram-se um importante tópico de pesquisa. No entanto, experimentos in vivo com voluntários humanos não são ideais para tais estudos devido à bioética e restrições econômicas. Como resultado, modelos animais têm sido utilizados para avaliar essas interações in vivo. No entanto, estudos de modelos animais ainda são limitados por considerações de Bioética, além de diferentes composições e diversidades de microbiota em animais versus humanos. Uma estratégia de pesquisa alternativa é o uso de experimentos de fermentação em lote que permitam a avaliação das interações entre endobióticos e microbiota intestinal in vitro. Para avaliar esta estratégia, os exopolissacarídeos bifidobacterianos (bif) (EPS) foram usados como um xenobiótico representativo. Em seguida, as interações entre bif EPS e microbiota intestinal humana foram investigadas usando vários métodos, tais como cromatografia em camada delgada (TLC), análise composicional da comunidade bacteriana com sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA e cromatografia gasosa de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). Aqui apresentamos um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentação em lote in vitro. É importante ressaltar que este protocolo também pode ser modificado para investigar interações gerais entre outros endobióticos e microbiota intestinal.
Introduction
A microbiota intestinal desempenha um papel importante no funcionamento dos intestinos humanos e na saúde do hospedeiro. Consequentemente, a microbiota intestinal tornou-se recentemente um importante alvo para a prevenção e terapia da doença1. Além disso, as bactérias do intestino interagem com as células intestinais do hospedeiro e regulam os processos de acolhimento fundamentais, incluindo atividades metabólicas, disponibilidades de nutrientes, modulação do sistema imunológico e até mesmo função cerebral e tomada de decisão2,3 . Os endobióticos têm um potencial considerável para influenciar a composição bacteriana e a diversidade da microbiota intestinal. Assim, as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana têm atraído a atenção crescente da pesquisa4,5,6,7,8,9.
É difícil avaliar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana in vivo devido à bioética e restrições econômicas. Por exemplo, experimentos que investigam as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana não podem ser realizados sem a permissão da administração de alimentos e drogas, e o recrutamento de voluntários é caro. Conseqüentemente, os modelos animais são usados frequentemente para tais investigações. No entanto, o uso de modelos animais é limitado devido a diferentes composições de microbiota e diversidade em comunidades animais vs. humanas associadas. Um método alternativo in vitro para explorar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana é através do uso de experimentos de cultura de lotes.
Os exopolissacarídeos (EPSs) são prebióticos que contribuem significativamente para a manutenção da saúde humana10. Os EPSS distintos que consistem em composições e em estruturas diferentes do monossacarídeos podem expor funções distintas. As análises prévias determinaram a composição de BIF EPSs, que são o xenobiótico representativo apontado no estudo atual11. No entanto, os efeitos metabólicos associados ao hospedeiro não foram considerados em relação à composição e diversidade do EPS.
O protocolo descrito aqui usa a microbiota fecal de 12 voluntários para fermentar bif EPSs. A cromatografia de camada fina (TLC), o sequenciamento do gene 16S rRNA de alta taxa de transferência e a cromatografia gasosa (GC) são então usadas em combinação para investigar as interações entre EPSs e microbiota intestinal humana. As vantagens distintas deste protocolo em comparação com experimentos in vivo são seu baixo custo e evitação de efeitos interferentes do metabolismo do hospedeiro. Além disso, o protocolo descrito pode ser utilizado em outros estudos que investiguem interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Registaram-se progressos significativos no sentido da compreensão da composição e das actividades da microbiota intestinal humana na última década. Como consequência desses estudos, surgiu o conceito de holobiont, que representa as interações entre hospedeiros e comunidades microbianas associadas, como entre humanos e sua microbiota intestinal19,20. Além disso, os seres humanos são considerados mesmo agora como superorganismos21,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de ciência da natureza da China (no. 31741109), a Fundação de ciência natural de Hunan (no. 2018JJ3200), e o programa de construção da disciplina característica aplicada na Universidade de ciência e engenharia de Hunan. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) pela sua assistência linguística durante a preparação deste manuscrito.
Materials
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
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